质粒的复制特性和整合后在发动大肠杆菌染色体复制中对recA基因的依赖性的研究

大肠杆菌的温度敏感的DNA复制发动突变型dnaA46在42℃中不能生长而形成菌落,质粒或噬菌体的整合使它能生长。前文[2]报道了F质粒整合后所发动的染色体复制依赖于recA基因。本文报道5种质粒和2种噬菌体整合后所发动的染色体复制对recA基因的依赖性的研究结果。实验结果说明,依赖与否和它们在游离状态中复制方向无关,从而否定了recA基因的作用是把质粒或噬菌体的游离状态的单向复制发动机构改变为整合状态的双向复制发动饥构这一假设。     

大肠杆菌中整合的F′质粒带动细菌染色体复制需要recA基因

大肠杆菌的dnaA46突变能被F′质粒整合抑制。整合抑制的菌林(Sin菌株)在通过转导引入了recA56突变后又变得不能在40℃中生长。标记转移、吖啶橙敏感性,F′质粒消除和mini-染色体质粒转化等实验说明,Sin菌株中F′质粒始终处于整合状态,并且在40℃中细菌染色体的复制由整合状态的F′质粒所带动。比较了Sin recA~ 和Sin recA~-菌株在不同温度中的DNA、蛋白质的生物合成情况。实验结果说明recA基因在DNA复制过程中起作用。前人的工作证明了recA基因在DNA重组和DHA损伤应急修复(SOS)过程中是一个关键的基因。本文的工作为recA基因的功能提供了新的认识。     

带有特定染色体片段的mini-F质粒所发动的染色体复制对于recA基因的依赖性

构建了一些带有大肠杆菌的特定染色体片段的mini-F质粒,使它们通过同源重组整合在dnaA46细菌的染色体的预定位置上,然后测定整合抑制菌株(sin)在40℃中染色体复制对recA基因的依赖性。实验结果说明,Sin菌株对recA基因的依赖性决定在质粒的整合位置。整合在oriC近旁的Sin菌株不依赖于recA基因;整合在oriC和terC中间的只在丰富培养基上是依赖的;整合在rerC附近的在不丰富的培养基上也依赖于recA基因。     

通过同源重组构建酿酒酵母新型表达质粒

利用同源重组的方法, 构建了具有高拷贝数和高稳定性的新型酿酒酵母表达质粒. 对酵母附加体型载体pHC11进行一系列改造, 得到质粒pHC11R, 并用适当的酶切线性化; 利用PCR反应得到人IFNα2b表达单元片段, 它的两端和线性化的pHC11R的两端具有50 bp左右的同源区段. 上述两个片段共转化酿酒酵母, 在酵母体内经同源重组后得到表达质粒pHC11R-IFNα2b, 该表达质粒与 pHC11-IFNα2b相比去除了质粒上用于在大肠杆菌中复制和筛选所需的序列, 在宿主菌中的稳定性和拷贝数均有明显提高, 同时外源基因的表达量也获得了一定程度的提高. 在此基础上, 进一步构建了带有不同表达元件的pHR系列载体, 使得外源基因能够通过同源重组在酿酒酵母中快速、方便地克隆和表达.     

植物基因同源重组研究现状

同源重组是普遍存在的生物学现象,从噬菌体、细菌到真核生物均有存在。它对生物的遗传与变异具有重大影响,一直是生物学家研究的热点。本文从染色体外同源重组、染色体内同源重组以及基因打靶三个方面综述了同源重组在植物方面的研究现状。从分子水平上较详尽的介绍了同源重组发生的机制以及同源重组在生物领域的应用、前景展望及其存在的局限性。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF267640和AF267641）,并以此作为定点整合源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成pgb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF.酶切及Southem杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

细菌内同源重组法构建靶向Survivin 的腺病毒载体的研究

目的:研究细菌内同源重组法构建靶向Survivin的腺病毒载体及其体外扩增表达。方法:将survivin基因克隆至穿梭质粒载体中,特异性酶切后回收、连接、转化,构建负载survivin片段的重组腺病毒载体。提取重组病毒基因酶切鉴定后,包装成病毒,并扩增到所需滴度。行Western blotting鉴定,观察重组腺病毒载体在真核细胞的表达。结果:(1)重组穿梭质粒的Mlu I酶切鉴定结果显示,酶切结果均与相应的载体及目的片段的大小相符合,基因测序结果基本一致。(2)凝胶电泳产生了两条大约15 kb和8.5kb的片段,由图2可知重组腺病毒质粒酶切充分完全,且回收率较高。(3)重组腺病毒载体转染AD293细胞24 h后已出现细胞病变效应,病变细胞细胞核变大。(4)D260/OD280的值为1.92,表明重组腺病毒纯度较高。(5)AD293细胞病毒上清中有能与抗Survivin单抗反应的蛋白,其相对分子质量与理论值相吻合,阴性对照组无对应条带出现。结论:本方法成功构建表达了含Survivin的重组腺病毒载体,为进一步进行Survivin基因功能的研究提供了实验基础和理论支持。     

Specificity in suppression of SOS expression by recA4162 and uvrD303

Detection and repair of DNA damage is essential in all organisms and depends on the ability of proteins recognizing and processing specific DNA substrates. In E. coli, the RecA protein forms a filament on single-stranded DNA (ssDNA) produced by DNA damage and induces the SOS response. Previous work has shown that one type of recA mutation (e.g., recA4162 (I298V)) and one type of uvrD mutation (e.g., uvrD303 (D403A, D404A)) can differentially decrease SOS expression depending on the type of inducing treatments (UV damage versus RecA mutants that constitutively express SOS). Here it is tested using other SOS inducing conditions if there is a general feature of ssDNA generated during these treatments that allows recA4162 and uvrD303 to decrease SOS expression. The SOS inducing conditions tested include growing cells containing temperature-sensitive DNA replication mutations (dnaE486, dnaG2903, dnaN159, dnaZ2016 (at 37 °C)), a del(polA)501 mutation and induction of Double-Strand Breaks (DSBs). uvrD303 could decrease SOS expression under all conditions, while recA4162 could decrease SOS expression under all conditions except in the polA strain or when DSBs occur. It is hypothesized that recA4162 suppresses SOS expression best when the ssDNA occurs at a gap and that uvrD303 is able to decrease SOS expression when the ssDNA is either at a gap or when it is generated at a DSB (but does so better at a gap).     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

带有IS1的mini—F质粒所发动的染色体复制对于recA基因的依赖性

我们曾报道整合的F′质粒所发动的大肠杆菌染色体复制依赖于recA基因,而整合的F质粒则不。构建带有IS1的mini-F质粒,它们的复制起点分别来自F或F′质粒。这些质粒的整合抑制菌株中都有约20％是recA依赖的,不管这一mini-F质粒的复制起点来自F或F′质粒,也不管这一质粒在游离状态中的复制方向是单向或双向。实验结果说明,质粒的整合位置是决定由整合质粒所发动的染色体复制对recA基因的依赖性的主要因素。     

整合型vgb基因载体的构建和研究

运用染色体-质粒同源基因重组的方法将外源Vitreoscilla血红蛋白基因(vgb)整合在大肠杆菌JM105染色体的苏氨酸操纵子位置上,构建单拷贝的vgb表达载体VGl。VGl保持了vgb基因的生理功能,可在低氧条件下表达Citreoscilla血红蛋白使细胞适应贫氧环境;同时它克服了以质粒作为表达载体时vgb基因剂量和表达量过高带来的生理负担,因此可作为一种适于高密度培养的基因工程宿主菌。实验结果还显示vgb基因的表达使VGl与普通大肠杆菌相比在低氧条件下仍能维持较高的呼吸强度,说明vgb基因产物参与了细胞处于低氧水平时的代谢过程。     

猪防御素基因PBD-I在大肠杆菌中的重组和融合表达

用RT-PCR方法获得PBD-I基因,将该基因插入原核表达载体PinPoint^TMXa-3中,重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达。SDS-PAGE电泳显示PBD-I基因在目标位置17kDa处获得了表达。PBD-I基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究形成基础。     

利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除

利用含有质粒pKD4 6的菌株BW2 5 113,在阿拉伯糖诱导后 ,表达λ噬菌体的 3个重组蛋白 ,宿主菌就具有了同源重组的能力 .设计的引物 5′端有 5 0bp的拟敲除基因的同源臂 ,3′端为扩增引物 ,以pKD3为模板 ,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因 ,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞 ,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体 .再利用表达Flp重组酶的质粒pCP2 0 ,可将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除 .利用该重组系统 ,构建了ClpP蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株 ,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用 .