荧光素酶研究进展*

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg²⁺、ATP、O₂ 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =550～580nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH₂ 和O₂ 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

两种萤火虫荧光素酶活性检测方法的一致性比较

目的：比较2种萤火虫荧光素酶活性检测方法的一致性。方法：分别采用化学发光技术（Che）及活体光学成像技术（Bio）,从细胞和动物水平检测在转染以萤火虫荧光素酶为报告基因的载体pCI-AAA-Fluc-neo后不同时间点,萤火虫荧光素酶的表达强度。结果：在细胞和动物水平,萤火虫荧光素酶的表达强度均随时间推移逐步递减。在HepG2细胞,萤火虫荧光素酶表达持续96h,活性从24h的2781±220mV（1．6×10^6±2．3×10^5光子）降至96h的49±3．5mV（6．4×10^4±2．5×10^4光子）。在动物水平得到相似的结果,BALB／c小鼠萤火虫荧光素酶表达持续20d,其活性从1d的16592±409mV（1．9×10^8±3．6×10^6光子）降至20d的798±139mV（3．37×10^5±3．8×10^4光子）。通过一致性检验,2种检测方法在细胞和动物水平的直线回归方程分别为lgChe=1．186·lgBio-3．764（r=-0．937,P〈0．001）和lgChe=0．451·lgBio＋0．64（r=0．915,P〈0．001）;进一步将理论数据与实验数据进行配对t检验,二者无统计学差异（P〉0．05）。结论：2种检测方法是一致的;从整个实验过程来看,活体光学成像技术较化学发光法更为简便、直观,可量化地对同一个体连续检测,减少了个体间差异和实验动物用量。     

在大肠杆菌中合成的萤火虫荧光素酶的分离和性质

用生物工程技术将萤火虫荧光素酶基因转移到大肠杆菌,在大肠杆菌中合成荧光素酶。这种工程菌已可通过发酵大量培养,并从菌体分离得到接近纯化的荧光素酶。这种酶的分子量是103kD;巯基试剂5,5’-巯基-2(2-硝基苯甲酸)“DTNB”能抑制酶的活性;对于底物荧光素的K_m为1.2μmol/L;酶反应最适pH为7.77;酶催化的生物发光峰在560nm。     

细菌荧光素酶体外发光体系的建立及应用于NADH定量检测

摘要：【目的】本研究旨在建立鳆发光杆菌（Photobacterium leiognathi）YL 荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系,并对荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系应用于NADH的定量检测进行初步探索。【方法】利用从鳆发光杆菌提取并经部分纯化的荧光素酶和FMN-NADH氧化还原酶,通过优化体系中各底物的添加量,实现荧光素酶的体外发光。【结果】荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系为：1 mL酶液中添加100 μL十二烷醛（27 mmol/L）、0.5 μL FMN-Na（10 mmol/L）、300 μL NADH（0.14 mmol/L）。NADH与荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体系的发光强度呈良好的线性关系,其线性范围为1.0×10-10 ～1.0×10-8 mol/L。【结论】荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系可以简便、灵敏、快速的定量检测NADH,为其进一步应用于环境检测、食品卫生与安全等领域活细菌数量的检测奠定了基础。     

荧光素酶及其应用

介绍了细菌荧光素酶基因(lux)和萤火虫荧光素酶基因(luc)的结构特点和二者的差异,概述了该酶作为报告基因在基础研究和实践(污染物监测、急性毒性和遗传毒性监测、微生物监测等)中的应用,肯定了该酶作为报告基因的广阔应用前景。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

生物素化荧光素酶的克隆表达及其固定化研究

为了在体内实现萤火虫荧光素酶的生物素酰化修饰,我们将大肠杆菌中编码生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）C端87个氨基酸的功能域基因融合到萤火虫(Pyrocoelia pectoralis)荧光素酶cDNA的末端。经大肠杆菌生物素合成酶（biotin holoenzyme synthetase）的催化,生物素与BCCP上特定的赖氨酸（Lys）残基共价结合,由此与BCCP融合的萤火虫荧光素酶间接实现了生物素化的修饰。利用生物素与配体亲和素或链霉亲和素的特异性耦合,可以将荧光素酶固定到亲和素或链霉亲和素包被的磁珠上,从而使荧光检测的应用更加灵活和方便。本文将就生物素化荧光素酶的克隆、表达以及功能检测进行具体讨论。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5＇NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

萤火虫荧光素酶的研究及开发利用

萤火虫荧光素酶的研究及开发利用蒋宇扬,金振华（中科院发育研究所１０００８０）萤火虫荧光素酶（ＦｉｒｅｆｌｙＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ;ＥＣＩ．１３．１２．７）简称虫光素酶,是一种能将化学能转变为光能的活性蛋白质,即生物催化剂。由于它能把诸如ＡＴＰ（三磷酸腺苷）一类生化物质转变成易于检测的先信号。因此,它能构成极好的生物传感器（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）。