GFP基因转化香樟胚性愈伤组织的研究

以香樟胚性愈伤组织作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因(GFP)的遗传转化研究。经农杆菌侵染后的胚性愈伤组织通过共培养、选择培养后获得抗性愈伤组织和体胚,对抗性愈伤组织及体胚的诱导过程进行了GFP荧光检测。结果表明,GFP基因能在抗性愈伤组织和体胚中强烈表达,证明GFP基因能够在香樟遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的PCR检测初步证实外源GFP基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中。     

农杆菌介导的胀果甘草愈伤组织遗传转化

目的:旨在建立一个农杆菌介导的甘草愈伤组织遗传转化的可行方案,并对转化条件进行优化。方法:选择EHA105和LBA4404两种根癌农杆菌菌株,热激法转入含有绿色荧光蛋白GFP基因的植物表达载体pBI121-gfp,挑选转化的农杆菌用于侵染胀果甘草愈伤组织。设置不同培养时间的愈伤组织作为受体材料和农杆菌不同侵染时间两组条件,经共培养后的甘草愈伤组织进行荧光检测。结果:愈伤组织在含有100mg/l卡那霉素的继代培养基上进行筛选培养,得到了具有卡那霉素抗性的转化甘草愈伤组织,转化愈伤组织经继代培养基后在紫外光下仍可见绿色荧光,PCR检测转化愈伤组织基因组中含有gfp基因。结论:试验建立了农杆菌介导的甘草愈伤组织的遗传转化体系,为目的基因导入甘草细胞利用基因工程手段调控甘草次生代谢产物生物合成的研究奠定了基础。     

甘蔗转基因甘露糖筛选系统的建立

以甘露糖作为筛选底物,对甘蔗品种新台糖22号进行临界筛选浓度测定,获得愈伤组织的继代、分化、生根的临界筛选浓度。而后应用含有甘露糖筛选标记基因pmi及绿色荧光蛋白报告基因GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导法对新台糖22号的愈伤组织进行遗传转化。用所测定的临界筛选浓度先后进行继代、分化、生根筛选培养,获得抗性植株。对获得的抗性植株分别进行pmi基因和GFP基因的PCR检测,以及GFP显微镜荧光检测,结果证实已成功建立了高效的甘蔗转基因甘露糖筛选系统。     

绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达

目的:将绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)重组到胡萝卜愈伤组织细胞中,使其获得表达,为今后利用GFP基因作为植物报告基因提供条件。方法:通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体PBI1121转入到根癌农杆菌EHA105中,再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组织细胞中,经过除菌和抗性筛选后观测转化结果。结果:荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光,利用PCR法扩增出约740bp的目的基因片断。结论:GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达。     

茉莉茎段遗传转化体系初步研究

以双瓣茉莉(Jasminum sambac)一年生茎段为外植体,探索茉莉花遗传转化体系。结果显示,预培养7 d后进行农杆菌侵染,然后置于含卡那霉素(Kan) 80～100 mg·L-1的筛选培养基上培养可获得成活率较高的抗性茎段。GFP转化预培养7 d的茉莉茎段再培养3 d及30 d后,以及转化预培养20 d茉莉茎段愈伤再培养14 d后愈伤组织中均能检测到GFP荧光。说明利用该转化系统进行茉莉遗传转化是可行的。     

两种筛选标记基因在水稻(Oryza sativa L.)遗传转化中的比较

筛选标记的有效选择(筛选周期及筛选效率)是影响作物基因转化成败的重要因素之一。该文在农杆菌介导水稻转化过程中,比较研究了两个标记基因(hpt和bar基因)对抗性愈伤组织产生时间及出愈率的影响。结果表明：以hpt为筛选标记,抗性愈伤组织出现周期短,出愈率高达20％左右;而bar基因作为筛选标记时,抗性愈伤组织块出现较慢,出愈率仅10％左右。因此,在水稻的农杆菌转化中,仅作为筛选标记,hpt基因的效果要明显优于bar基因。     

基因枪介导的大蒜遗传转化体系的建立

以大蒜无菌苗根诱导的愈伤组织为受体进行基因枪转化,根据愈伤组织的形态特征设计了6组基因枪转化参数进行试验。结果表明,其中4组转化试验都获得了转基因植株;轰击距离9 cm、压力1100 psi和轰击距离12.5 cm、压力1300 psi各轰击1次的轰击方式获得了最高的转化效率,为2.4%。对抗性植株进行了PCR和Southern blot检测,证明pCAMBIA1301载体上的潮霉素抗性选择标记基因和gus报告基因已整合到抗性植株的基因组中。对转化后的愈伤组织、胚状体、根、再生芽尖和叶片进行gus基因的表达检测,抗性材料显示出明显的蓝色反应。这些结果表明已初步建立了基因枪介导的大蒜遗传转化体系,将为大蒜的基因工程改良奠定基础。     

利用gfp报告基因优化农杆菌介导的水稻遗传转化

为提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率,以晚粳97为转化材料,绿色荧光蛋白gfp基因为报告基因,采用正交试验L9(33)对影响农杆菌介导水稻的遗传转化因子进行优化。通过观察愈伤组织荧光表达情况,分析菌液浓度、共培养温度与共培养时间对农杆菌转化水稻的影响。结果表明,在OD660值为0.1、共培养21℃～23℃黑暗条件下,农杆菌与水稻愈伤共培养72 h,最有利于水稻的遗传转化,该条件下晚粳97愈伤组织荧光表达率达到70.9%。     

洋桔梗的转基因研究

以叶盘为外植体,通过农杆菌菌株C58Cl(pPMP90)介导,开展了用植物表达载体pK2-35S-GFP(含GFP基因)转化洋桔梗(Eustoma russellianum)的研究。洋桔梗叶盘用农杆菌浸染15-20min,在共培养基上与农杆菌共培养2d后,转移到分化培养基上诱导愈伤组织。10d后选取部分叶盘在紫外灯下观察GFP的荧光亮点,结果80%以上的叶盘都有GFP的荧光亮点,说明农杆菌对叶盘的感染效率很高。在分化培养基上红花洋桔梗叶盘不定芽分化频率约为30%,把分化培养基上形成的小苗转移到含有Km(20mg/L)的生根培养基上,进行生根诱导筛选具有Km抗性的转基因植株,统计结果说明红花洋桔梗的转化效率为2.4%。随机选取4株具有Km抗性的洋桔梗植株进行PCR检测,结果均为阳性,证明GFP基因已整合到洋桔梗基因组中,选取经PCR检测为阳性的植株叶片,用激光共聚焦显微镜观察,结果发现有GFP的绿色荧光出现在叶片细胞质中,说明叶片中有GFP蛋白的表达,转化试验成功。     

GFP基因在棉花转化中的应用

以绿色荧光蛋白GFP基因为报道基因,用花粉管通道和农杆菌介导的转化方法将外源基因导入棉花（Gossypium hirsutum L.)分别获得转化幼胚,幼苗和转化愈伤组织,用手持紫外灯结合显微镜检术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定,比用GUS检测广阔圾明显的优越性,本研究不但为花粉管道道转化法的可行性提供了新的证据。同时也建立了GFP用于棉花基因工程研究的检测技术体系。