核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅰ.萤光试剂的制备和核苷二醛、5′-次甲基核苷二醛的萤光标记

本文报告了两种萤光试剂的制备方法并用一种萤光试剂标记了四种核苷二醛和四种5'-次甲基核苷二醛。萤光试剂Ⅰ,1-二甲氨基萘-5-磺酰-甘氨酰肼(DNS-Dly-NHNH_2)的制备方法:1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)与甘氨酸乙酯(Gly-OC_2H_5)反应,得1-二甲氨基萘-5-磺酰-甘氮酸乙酯(DNS-Gly-OC_2H_5),DNS-Gly-OC_2H_5经肼解得DNS-Gly-NHNH_2。萤光试剂Ⅱ,1-二甲氨基萘-5-磺酰肼(DNS-NHNH_2)的制备方法:1-二甲氨基萘-5-磺酰氯直接肼解得1-二甲氨基萘-5-磺酰肼(DNS-NHNH_2)。DNS-Gly-NHNH_2与腺苷二醛,鸟苷二醛,胞苷二醛以及尿苷二醛反应,分别得到四种萤光标记的核苷腙:DNS-Gly-_(HO)A_R,DNS-Gly-_(RO)G_R,DNS-Gly-_(HO)C_R,以及DNS-Gly-_(HO)U_R。DNS-Gly-NHNH_2与5'-次甲基腺苷二醛,5'-次甲基鸟苷二醛,5'-次甲基胞苷二醛以及5'-次甲基尿苷二醛反应,分别得到四种萤光标记的5'-次甲基核苷腙:DNS-Gly-_(H_2)A_R,DNS-Gly-_(H_2)G_R,DNS-Gly-_(H_2)C_R以及DNS-Gly—_(H_2)U_R。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅱ.萤光试剂及其核苷腙的一些性质

使用化学降解核苷腙的方法证明核苷二醛与DNS-Gly-NHNH_2的结合为1:1。观察了DNS-Gly-NHNH_2及其核苷腙的聚酰胺薄板层析及电泳行为;测定了在水、乙醇、二氧六环中的紫外吸收光谱与克分子消光系数以及萤光光谱和量子产率。DNS-Gly-NHNH_2及其核苷腙的萤光强度随溶剂极性降低而增大。在二氧六环中它们的量子产率为0.4左右。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅱ.萤光试剂及其核苷腙的一些性质

使用化学降解核苷腙的方法证明核苷二醛与DNS-Gly-NHNH_2的结合为1:1。观察了DNS-Gly-NHNH_2及其核苷腙的聚酰胺溥板层析及电泳行为;测定了在水、乙醇、二氧六环中的紫外吸收光谱与克分子消光系数以及萤光光谱和量子产率。DNS-Gly-NHNH_2及其核苷腙的萤光强度随溶剂极性降低而增大。在二氧六环中它们的量子产率为0.4左右。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA进行了顺序分析。片段用量为0.16A_(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-GIy-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase 酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA 进行了顺序分析。片段用量为0.16A~(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅳ.寡核糖核苷酸3′-端的显色标记微量测定法

本文报告用甲基橙为原料合成了甲基橙的两种衍生物:4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰-甘氨酰肼(DABS-Gly-NHNH_2,Ⅰ)和4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰肼(DABS-NHNH_2,Ⅱ),并用(Ⅰ)成功地标记了高碘酸氧化的核苷二醛。标记产物在聚酰胺薄板上分离得很好,其灵敏度达到10~(-9)～10~(-10)克分子,比紫外吸收法灵敏数十倍。我们用试剂(Ⅰ)标记测定了四种不同的寡核糖核苷酸的3'-端,用量为0.08～0.12A_(260)。     

8位~3H标记的脱氧腺嘌呤核苷5′-一磷酸的制备

前言8位氚标记脱氧腺嘌呤核苷5＇-一磷酸(以下简写为~3H-dAMP)可用于脱氧核糖核酸结构分析及代谢研究,还可以转变成脱氧腺三磷(~3H-dATP)。我们遵照毛主席“独立自主,自力更生”的     

核糖核酸结构的研究 Ⅰ.小型两向电泳层析方法

进行核糖核酸結构的研究,除需要特异性強的核酸酶外,还必須具备分离酶解产物的良好方法。关于RNA~(**)酶解产物的分离,前人曾經使用过Dowex-1、ECTEOLA、DEAE、DEAE-Sephadex等阴离子交换剂进行柱层析,并取得不少成果,柱层析法虽有其优点,但时間长,工作量大,耗样品量多,且分离效果也不十分滿意,例如,A_pC_p、     

大肠杆菌可溶性核糖核酸结构的研究 Ⅰ.可溶性核糖核酸的结构分析和一种测定核苷酸分布的方法

(一)利用不同工具酶和化学因素对于核酸的特异降解作用,提出一种简便的系统分析S-RNA RNase I降解物的方法。方法共分四个步骤,连续在纸上进行,可以测定末端以及—PypCpNp—,—PypUpNp—,—PypApNp—,—PypGpNp—,—PupApNp—,—PupGpNp—,—PupCpNp—,—PupUpNp—在核酸链中的分布。(二)对大肠杆菌S-RNA的内部结构进行了分析,得到以下结论:(1)在S-RNA链中,嘧啶或嘌呤核苷酸有“成堆”的排列。属于这种排列的核苷酸,嘧啶占总嘧啶量的56.5%;嘌呤占总嘌呤量的56.4%。(2)S-RNA经RNase I降解后多核苷酸片段(Pup)_nPyp中,嘧啶端C>U,C/U比值为1.5;嘌呤端G>A,G/A比值为1.2。(三)大肠杆菌S-RNA根据本方法分析结果计算,由76±1核苷酸残基组成(未包括(?)Up),分子量约为25000±1000,与应用核碱组成分析计算的结果基本符合。(四)根据—PupCpNp—与—PypGpNp—以及—PupUpNp—与—PypApNp—的测定值基本相同一点,讨论了S-RNA双螺旋结构,核碱成G—C、A—U对排列的可能性。并估计在S-RNA链中,少数不成对排列的碱基,可能分布于嘧啶或嘌呤“成堆”的链节中。     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2′-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2·7·7·26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNaseN_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAMSephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04M DTPJ 0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUp(UpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2’-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2.7.7.26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端接受茎区八核苷七磷酸GpUpCpGpupCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNase N_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAESephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04MDTP,0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUpCpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

核酸化学结构的研究——Ⅰ.1-氟-2,4-二硝基苯与可溶性核糖核酸的反应

(一)本工作报告了FDNB与RNA的作用条件,并研究了不同断裂程度的RNA和FDNB的反应。(二)对DNP-在大肠杆菌S-RNA分子中的结合位置通过紫外线吸收光谱和牛胰RNase以及蛇毒磷酸双酯酶的降解作用做了探讨,由实验结果推断:DNP-似结合在S-RNA末端5′-G核苷酸的磷酸单酯上。(三)本文说明DNP-的结合量可以用来计算S-RNA的链长及分子量;也可以利用DNP-标记pG末端,以便利于该末端核苷酸排列顺序的研究。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-0-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是: 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5′-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2′(3′)-O-甲氧乙基-5′核苷二磷酸(ppN-2′(3′)-O-ME):ppA-2′(3′)-O-ME,ppG-2′(3′)-O-ME,ppC-2′(3′)-O-ME,ppU-2′(3′)-O-ME,以及ppΨ-2′(3′)-O-ME,产率一般为50～70%。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-O-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是:(1) CH_3CHO+CH_3OH+HCl -20℃→CH_3OCH(Cl)CH_3+H_2O(2) CH_3OCH(Cl)CH_3+C_5H_5N -20°→[CH_3OCH(Cl)CH_3·C_5H_5N](3) [CH_3OCH(Cl)CH_9·C_5H_5N] -120°→CH_3OCH=CH_2+C_5H_5N·HCl 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5’-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2’(3’)-O-甲氧乙基-5’-核苷二磷酸(ppN-2’(3’)-O-ME):ppA-2’(3’)-O-ME,ppG-2’(3’)-O-ME,ppC-2’(3’)-O-ME,ppU-2’(3’)-O-ME,以及ppΨ-2’(3’)-O-ME,产率一般为50～70%。     

1-甲基次黄苷抗体的制备、鉴定及其在酵母丙氨酸转移核糖核酸研究中的应用

本文制备了m~1I专一性抗体。经过双向琼脂扩散实验,微量免疫沉淀抑制实验,半抗原结合抑制实验及亲和层析实验证明:抗体可以特异性地与m~1I相结合。可以和含有该核苷的tRNA_y~(ala)的反密码环部位结合。这种结合并不影响tRNA_y~(ala)t与鼠肝氨酰基-RNA合成酶相互识别。似乎从较为直接的意义上说明:反密码环部位不参与tRNA_y~(ala)分子与相应的鼠肝氨酰基-tRNA合成酶的识别。文中强调了用于核酸大分子研究的核酸类物质抗体,必须去除核酸酶的污染。用固相化的m~1I抗体进行亲和层析,可能是一种纯化tRNA_y~(ala)的有用手段。     

1-甲基次黄苷抗体的制备、鉴定及其在酵母丙氨酸转移核糖核酸研究中的应用

本文制备了m~1I~*专一性抗体。经过双向琼脂扩散实验,微量免疫沉淀抑制实验,半抗原结合抑制实验及亲和层析实验证明:抗体可以特异性地与m~1I相结合。可以和含有该核苷的tRNA_y~(ala)的反密码环部位结合。这种结合并不影响tRNA_y~(ala)t与鼠肝氨酰基-RNA合成酶相互识别。似乎从较为直接的意义上说明:反密码环部位不参与tRNA_y~(ala)分子与相应的鼠肝氨酰基-tRNA合成酶的识别。文中强调了用于核酸大分子研究的核酸类物质抗体,必须去除核酸酶的污染。用固相化的m~1I抗体进行亲和层析,可能是一种纯化tRNA_y~(ala)的有用手段。     

2′—5′寡聚腺苷酸衍生物的研究——Ⅰ.以2′-5′寡聚腺苷酸作为T_4-RNA连接酶的供体和受体合成其衍生物的方法

在干扰素的功能表达中,2′-5′寡聚腺苷酸是一类重要的媒介物。本文研究了T_4-RNA连接酶的专一性及其用于2′-5′寡聚腺苷酸衍生物合成的可能性。1980年,我们曾发现2′-5′寡聚腺苷酸可以作为RNA连接酶的受体。本文对此作了进一步的研究,证实了T_4-RNA连接酶可以将pNp(N=A,G,C,U)、pCpUpC、pCpm_2~2G等供体连到2′-5′P_3A_3受体上去,生成各种相应产物。2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸能否作为T_4-RNA连接酶的供体,有人估计不大可能。本文也证实了T_4-RNA连接酶能将供体pA~(2′)p~(5′)A连接到CpUpC、UpCpCpA、Cpm′IpψpG等受体上面去。从而说明T_4-RNA连接酶也可使用2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸作为供体。应用T_4-RNA连接酶,可以合成既含有2′-5′又含有3′-5′磷酸二酯键的寡核苷酸。本工作还证明A~(2′)p~(5′)A也可以作为T_4-多核苷酸激酶的底物。     

大鼠3′-甲基-4,4′-二甲基氨基偶氮苯(3′-MeDAB)诱癌过程甲胎蛋白的动态变化和免疫酶标记定位观察

本工作采用放射火箭电泳自显术和免疫酶标记定位技术,对大鼠3'-MeDAB诱癌过程血清和肝组织甲胎蛋白(AFP)的动态变化和定位情况进行了观察。发现(1)肝硬化假小叶内的少数肝细胞、嗜碱性间变再生结节细胞、少数“幸存肝细胞”及少数“过渡性细胞”,具有合成AFP的能力。未见肝内其他类型细胞合成AFP。合成AFP的细胞大多具有胞浆嗜碱性、生长活跃和形态上去分化的特点。(2)未见胆管癌细胞合成AFP。肝细胞癌分化好的癌细胞绝大多数也未见合成AFP,分化差的癌细胞合成AFP的能力,基本上与其生长活跃程度呈正相关,与分化程度呈负相关,而与癌细胞是否处于核分裂阶段关系不大。(3)肝癌组织AFP酶标的强度和范围与血清AFP水平之间基本上有平行关系。此外,本文还就什么细胞合成AFP、血清AFP“马鞍型”变化的成因及病理组织学基础等进行了讨论,并根据实验结果,对大鼠3'-MeDAB肝癌的组织发生提出了初步的设想。     

表观遗传学新标记——5-羟甲基胞嘧啶检测方法的研究进展

被称为"第六种碱基"的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC),广泛分布于多种哺乳动物的组织和细胞中,与胚胎发育,神经系统功能以及肿瘤研究高度相关.与5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)相比,5hmC在组织中含量更低,难以精确的检测.随着研究的深入,5hmC参与的重要生物学作用逐渐被人们发现,同时也促使着5hmC的检测和定量方法不断发展.为了区分5hmC与其他胞嘧啶衍生物,很多利用化学或者酶学修饰实现靶向检测或非靶向富集5hmC的方法应运而生.因此,选择并发展灵敏,准确,可靠的5hmC检测技术对于表观遗传研究至关重要.本文重点综述了近年来发展起来的5hmC检测和测序技术,通过比较分析各种方法的优缺点,为研究人员选择特定合适的方法开展相关研究提供重要的参考.