用基因组改组技术改良发酵木糖酵母Candida tropicalis XY-19的耐乙醇性能

Candida tropicalis XY-19是一株具有优良乙醇发酵性能的发酵木糖酵母,其发酵葡萄糖产乙醇性能与目前酒精工业生产菌种--安琪酒精酵母相近,但XY-19的耐乙醇性能远比安琪酒精酵母差,XY-19在含有超过7%(v/v)乙醇的培养基中不能生长。以XY-19为出发菌株,经紫外线诱变获得了5株能在7.5%(v/v)乙醇的培养基中旺盛生长的突变株,经Co-60诱变获得了8株能在含8%(v/v)乙醇的培养基中旺盛生长的突变株。然后,以紫外线诱变得到的5株菌和Co-60诱变得到的8株菌及耐乙醇性能较好的酿酒酵母(S.cerevisae Angel,S.cerevisae4608和S.cerevisae172)为出发菌株,经过4轮Genome shuffling结合木糖乙醇梯度平板的筛选,获得了4株(G3-13,G3-18,G3-57和G3-60)能够在12%乙醇平板上生长的菌株,其乙醇耐受性比野生菌株XY-19提高了71%,为将XY-19进一步开发成纤维质乙醇发酵的生产菌种奠定基础。本研究结果进一步体现了Genome shuffling技术在改良如乙醇耐受性等多基因控制性状上的突出优势,为工业生产菌种的快速有效改良提供了一种有效的方法。     

拆分获得(R)-酮基布洛芬酯酶基因的筛选、克隆与表达

以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌Bacillus megaterium NK13为材料,通过构建其基因文库,筛选得到一个阳性克隆重组子pUC18-NK-HYD3。分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的741 bp的开放阅读框,其编码的蛋白中含有酯酶的GXSXG保守序列。经在NCBI的BLAST系统中比对,证明该酯酶基因属于首次发现(GenBank Accession Number: GU143552)。将酯酶基因克隆到载体pET21b(+)中,转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后在宿主菌得到表达。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28 kDa。TLC和HPLC检测结果显示,该酯酶优先水解(R)-型底物,在重组菌菌液体系,转化率为15%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)最高,达62.74％;改用重组菌湿菌体的PBS体系后,在转化率为10%~50%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)一直保持在73%~76%之间。     

NK13中(S)- 酮基布洛芬拆分用酯酶基因的克隆及表达

以本实验室筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经初步鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),通过构建其基因文库,从中筛选得到一阳性克隆重组子pUC-NK。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为933bp的酯酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该酯酶基因属首次发现（GenBank登录号为DQ196347）,将此基因克隆到原核表达载体pET21b+中构建重组表达质粒pET-NKest,转化E.coli BL21,经IPTG诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为34KDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株的转化效率较原始菌有明显提高,由表达菌45min就能转化酮基布洛芬氯乙酯47.4％,而得到的(S)-酮基布洛芬过量（e.e.%）由野生菌NK13的5.84％提高到55.46％,提高将近10倍,说明该酯酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

基因组重排技术选育乙醇高产菌株

里氏木霉（Trichoderma reesei）被认为是最合适联合生物加工（consolidated bioprocessing）的微生物之一。原始里氏木霉菌株产乙醇能力太低,需要进一步提高其产酒量。我们通过基因组重排技术提高了里氏木霉菌株产乙醇能力和乙醇耐受力。首先对CICC40360菌株孢子进行NTG诱变得到正向突变菌株,再以此为出发菌株进行基因组重排。进行基因组重排后,重组菌株在含不同乙醇浓度的原生质体再生培养基上进行筛选。突变菌株和原始菌株一起做摇瓶发酵实验进行比较以确定产乙醇能力的提高。经过两轮基因组重排后,筛选获得表现最优异的重组菌S2-254。该菌株能在利用50g/l葡萄糖发酵出6.2g/l乙醇,同时能耐受3.5% （v/v）浓度乙醇。上述结果表明,本实验采用的基因组重排技术能够有效而且快速获得具有目的性状的优良菌株。     

混合添加乙醇和H2O2对嗜热子囊菌产过氧化氢酶的影响

在以嗜热子囊菌( T. aurantiacus WSH03-01BC)生产过氧化氢酶的7L罐发酵研 究中,发现混合添加适量的乙醇(75%)和H2O2可以促进菌体产酶.在发酵36h和 48h分别添加0.8%(v/v)的乙醇时,酶活比对照提高了34.3%;当添加乙醇的总量超过2.4 %时 ,对菌体的生长及产酶有明显的抑制作用;在发酵36～60h恒速流加1.6%的乙醇,CAT的酶活 达到2519U/mL,单位细胞产酶能力提高了47.3%;在发酵36h～60h恒速流加1.6%的乙醇并在4 8h混合添加0.4%的H2O2时,CAT的酶活达到2786U/mL,比对照提高了50.1% .     

注射用高纯度蛋黄卵磷脂制备新工艺的研究

本文探索建立了一条以新鲜蛋黄为原料,以乙醇为唯一提取溶剂,制备高纯度注射用蛋黄卵磷脂的新工艺。首先,用4倍重量的96%(v/v)乙醇作为沉淀剂将新鲜蛋黄中的蛋白质沉淀为滤饼,得到初级提取液;然后,再用4倍重量的96%(v/v)乙醇对滤饼抽提3次,提取残余卵磷脂,得到次级提取液。合并提取液,置9℃下静置分层,除去大部分蛋黄油。所得上清液上硅胶柱,用86%(v/v)的乙醇作为洗脱剂,纯化蛋黄卵磷脂,经高效液相色谱检测纯度达98%。并对提取过程进行了优化,得到最佳工艺条件:35℃的96%乙醇溶液,添加量为1∶4(w/w)提取蛋黄液,180 rpm转速下搅拌10 min。抽滤后,用60℃的96%乙醇提取滤饼3次,料液比为1∶4,静置15 min。最佳工艺条件下,蛋黄卵磷脂的提取率可达93.38%。     

L-丝氨酸生产菌的选育及不同碳源对发酵的影响

以一株黄假单胞属(Pseudomonas flava)菌株A3为出发菌株,经过紫外(UV)诱变和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理和选育,选育出一株能够以甲醇为唯一碳源的兼性甲基营养型菌JW-01(Mth~R、Gly~R)。在含甘氨酸30g/L、甲醇1%的发酵培养基中发酵3d后L-丝氨酸产量为6．2g/L,较出发菌株提高了67．6%。该菌具有较好的传代稳定性。     

表面展示表达果胶酯酶的重组酿酒酵母构建及乙醇发酵

【目的】以淀粉为原料的乙醇发酵工艺仍然是当前燃料乙醇的主要生产方式。然而,一些原料中含有的果胶物质不仅降低了乙醇产率,而且会导致醪液粘度增大,从而会进一步影响传质和传热、增加设备负担等。构建能够自主降解果胶质的重组酿酒酵母并应用于燃料乙醇生产是值得探索的领域。【方法】论文将来源于黑曲霉的果胶酯酶基因克隆于α因子信号肽下游并通过酵母α-凝集素C-端蛋白的介导构建了在细胞表面锚定表达果胶酯酶的重组酿酒酵母PE。【结果】重组酵母的果胶酯酶表达水平达到2.6 U/g(菌体湿重),并进一步鉴定了重组果胶酯酶性质。以甘薯粉为原料的同步糖化发酵实验中,重组酵母PE的乙醇浓度和乙醇转化率分别达到95 g/L和88.1%,与出发菌株相比提高了2.2%。更重要的是,表面展示果胶酯酶能够显著降低发酵过程中的发酵液粘度。【结论】通过在工业酿酒酵母表面展示表达果胶酯酶不仅能够提高糖化酶等的作用效果和酿酒酵母的代谢能力,而且能够显著降低乙醇生产过程中发酵液的粘度,将对工业规模乙醇生产在降低设备负担、节约能耗方面具有一定的潜在价值。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ发酵特性的研究

在添加5%(v/v)番茄汁的改良配方乳中对植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌或与嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌混合发酵的生长特性、发酵乳风味进行了研究.结果表明,在脱脂乳中添加5%(v/v)番茄汁可以明显缩短植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌发酵时的凝乳时间,提高其活菌数.在改良的配方乳中,三菌混合发酵制备的发酵乳具有良好的酸奶风味、无涩味.但与...     

塔克拉玛干沙漠腹地胡杨林土壤细菌多样性分析

【目的】对塔克拉玛干沙漠腹地胡杨林土壤细菌多样性进行初步探索,为下一步从中筛选可用于生物饲料或生物肥料的微生物奠定基础。【方法】采用可培养方法,进行细菌的分离纯化。对各菌株进行革兰氏染色及淀粉酶、酯酶、纤维素酶和NaCl耐受浓度的测定,并提取各菌株基因组DNA,进行16SrRNA基因扩增、测序及系统进化树的绘制,分析其多样性。【结果】共分离得到27株菌,其中放线菌门(Actinobacteria)16株,变形菌门(Proteobacteria)4株,厚壁菌门(Firmicutes)6株,拟杆菌门(Bacteroidetes)1株。革兰氏染色结果表明,5株菌为革兰氏阴性,其余为革兰氏阳性;酶活测定结果表明,15株菌具有淀粉酶活性,9株菌具有酯酶活性,9株菌具有纤维素酶活性;NaCl耐受浓度测定结果显示,NaCl浓度为2%时所有菌株均能生长,5%时能生长的有22株,15%时能生长的有1株。【结论】塔克拉玛干沙漠腹地胡杨林土壤中存在较丰富的细菌类群,且具有一定的酶学活性和NaCl耐受性,具有进一步研究开发的价值。     

新颖微生物低温酯酶EstP8的酶学性质研究与在手性催化中的应用

从假单胞菌Pseudonocardia antitumoralis HUP007基因组中克隆了一个1 041bp的酯酶基因EstP8,编码的蛋白具有377个氨基酸残基。在E.coli BL21（DE3）中实现酯酶EstP8的高效异源表达和纯化。EstP8为脂肪酶家族Ⅳ中的一员,具有HGGG保守序列。EstP8最适底物为对硝基苯酚乙酸酯（p-NPO）,最适温度和pH分别为50℃和8.0。EstP8催化p-NPO水解反应的活性、V_max和K_m分别达到105.19U/mg、89.4μM/min、1.144mM。EstP8在pH7.0~8.0范围内具有良好的pH稳定性;在4℃时,酯酶相对活力为41.78%,在10~40℃内具有很好温度稳定性。EstP8对大部分金属离子有很好的耐受性,低浓度的Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对该酶的活性有激活作用。辛烷、庚烷、甲苯、丙酮、DMF等有机溶剂对EstP8的活性同样具有激活作用。酯酶EstP8还可以通过水解拆分高效地制备手性（R）-1-苯基乙醇;添加有机溶剂可以很好地促进该酯酶的光学选择性和产率,在共溶剂甲苯的存在下,所制备的（R）-1-苯基乙醇的e.e.和产率可达91%和18%;在共溶剂DMSO的存在下,所制备的（S）-乙酸苏合香酯的e.e.和产率可达98%和60%。酯酶EstP8在手性生物催化等诸多工业领域有很好的应用潜力。     

过表达INO1基因提高酿酒酵母乙醇耐受性

为获得燃料乙醇生产菌株,通过基因工程改造,构建能够利用能源甘蔗汁发酵、乙醇产率高的酿酒酵母工程菌株。即过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1,敲除kanMX抗性基因,获得重组菌。对过表达菌株的乙醇耐受性进行分析。利用甘蔗汁进行发酵培养,采用气相色谱(GC)对发酵产物乙醇进行检测。结果显示过表达菌株YI2-1能够耐19%(V/V)的乙醇,利用20oBx甘蔗汁厌氧发酵乙醇积累量为13.10%(V/V),较出发菌提高了8.55%。而过表达菌株YI2-1△KP的最大乙醇积累量为13.17%(V/V),较出发菌提高了9.16%。研究表明通过过表达酿酒酵母ino1基因能够有效提高菌株细胞活力、乙醇耐受性。构建的工程菌可利用甘蔗汁发酵,具有较高的乙醇产量。     

VC二步发酵新组合菌系的研究

选用苏云金芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成一新组合菌系 ,其摇瓶发酵转化率较原菌系提高 4 .83% ,且具有耐受高浓度 (10 % )山梨糖的特性。在 4m3 发酵罐中 ,连续 4批发酵平均转化率较对照菌系提高 8.16 % ,周期缩短 2 3.7%。新菌组合系的发酵转化率与玉米浆浓度成正相关性 ,尿素浓度x2 =1.4 5 % (g/ 10 0mL)时 ,转化率达最大。     

塔拉单宁水解酶产生条件的研究

微生物通过发酵产酶可以将植物单宁降解成小分子酚类化合物或其衍生物,但培养条件对其产酶影响很大。论文采用固态培养法,对黑曲霉产生塔拉单宁水解酶的条件进行了研究。结果表明,当培养液中塔拉单宁浓度为75 g/L、葡萄糖浓度为3 g/L、(NH4)2SO4浓度为0.2 g/L2、50 mL锥形瓶装液量为25 mL、惰性载体用量为5.6%(w/v)、起始pH为5.5、接种量为12%(v/v)、30℃培养72 h时,该黑曲霉产生的塔拉单宁水解酶活力可达到44.29 U/mL,是其自然条件下酶活力(24.09 U/mL)的1.84倍;没食子酸产率达到79.3%。研究结果对于揭示塔拉单宁生物降解的机理具有一定的参考价值。     

一株厌氧嗜热杆菌生长及发酵特性的初步研究

论文对筛选并鉴定为Thermoanaerobacterium saccharolyticum菌株的生长、底物利用情况、产物生成以及酒精耐受性进行了研究。结果表明,该菌在以甘露糖、葡萄糖和木糖为碳源时生长较好,同时能够较好的利用木聚糖和木薯淀粉;最适底物浓度为15g/L;不同的葡萄糖:木糖比例对其生长无显著影响;能耐受的培养基最高初始酒精浓度为3%(V/V)。在5g/L的木聚糖、木糖和木薯淀粉培养基中发酵60h后,产物主要有乙醇、乳酸和乙酸,乙醇产量分别为0.824、0.867和0.916g/L。     

松生拟层孔菌乙醇提取物抗肿瘤作用及其机制的实验研究

目的:探讨松生拟层孔菌抗肿瘤作用及其机制.方法:采用乙醇提取与硅胶柱层析分离,并对其乙醇粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相提取物分别进行了体内(小鼠移植性肿瘤),外(采用Alamar Blue法)抗肿瘤活性研究.结果:松生拟层孔菌的乙醇粗提物,石油醚相,乙醇乙酯相在100ug/ml时,体外对NCI-H460细胞株具有增殖抑制作用,100mg/kg时对在体的H22瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性,并能诱导H22瘤细胞凋亡,显著提高荷瘤鼠血清中IL-2、TNF-a的水平.结论:松生拟层孔菌乙醇提取物具有抗肿瘤作用,并能增强机体的免疫功能.     

出芽短梗霉A5产胞外多糖发酵条件的优化及产物结构鉴定

基于筛选获得能够生产分子量较高且无色素的普鲁兰多糖酵母菌株,对其进行菌株鉴定、产多糖发酵条件优化和多糖产物鉴定,旨在为工业上普鲁兰多糖发酵提供新的菌株来源。以YPD固体培养基为筛选培养基,氯霉素为筛选压力,曲利苯蓝为筛选指示剂;通过形态学,ITS间隔序列分析对筛选出的A5菌株进行鉴定。采用单因子优化A5菌株的最佳发酵条件;利用普鲁兰酶酶解并结合薄层层析法、红外光谱以及凝胶渗透色谱进行结构鉴定和分子量的测定。A5菌株鉴定为出芽短梗霉属,并被命名为出芽短梗霉A5。最优的发酵条件8%(w/v)麦芽糖,1%(w/v)酵母粉,2%(w/v)蛋白胨,0.5%(w/v)K_2HPO_4,0.06%(w/v)(NH_4)_2SO_4,0.03%(w/v)CaCl_2,pH6,7%(v/v)接种量;经过结构鉴定得知:该菌株的胞外产物是普鲁兰多糖,分子量为63.84 kDa。由此获得了一株生产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株A5,产物无色素且分子量较高。经过初步的发酵条件优化,在最佳发酵条件下发酵培养后,获得普鲁兰多糖的产量为22.9 g/L。综合上述结果可知,菌株A5能够作为工业上生产普鲁兰多糖的重要候选菌株。     

新型β-葡萄糖苷酶BglD2异源表达及水解虎杖苷能力

从海洋细菌Bacillus sp.D1中克隆、重组表达β-葡萄糖苷酶BglD2,研究其酶学性质,并对其水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力进行分析。BglD2的最适催化温度和pH分别为45℃和6.5,在30℃和pH 6.5条件下的半衰期约为20 h。BglD2能够水解含β(1→3)、β(1→4)、β(1→6)等键型的多种底物。BglD2具有良好的糖促活特性,100 mmol/L葡萄糖和150 mmol/L木糖分别将酶活力提升2.0倍和2.3倍。BglD2具有较好的乙醇促活及耐受特性,30℃时,10%乙醇使酶活力提升1.2倍,25%乙醇存在时其仍保留60%的酶活力。BglD2具有水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力,35℃条件下反应2 h水解率为86%。具有乙醇耐受及抗产物抑制等特性的β-葡萄糖苷酶BglD2在酶法水解虎杖苷制备白藜芦醇方面有应用潜力。     

嗜盐碱球菌湛江新种的系统分类鉴定

根据经典微生物划线纯培养方法从湛江一个盐田泥样中分离获得1个嗜盐碱古菌菌株SCSIOCD13T,通过形态、细胞化学分类及分子发育等对其进行系统分类鉴定研究。经鉴定该菌细胞球形,好氧,革兰染色不定,在最适pH 8.5和37℃培养条件下,能够耐受2.5～5.5 mol/L盐浓度生长。16S rRNA基因序列比对分析显示,该菌株与嗜盐碱古菌Natronococcus属成员N.jeotgali B1T(99.2%),N.occultus NCMB 2192T(96.8%)和N.amylolyticus Ah-36T(95.8%)最相近,且系统发育树和细胞化学特征与Natronococcus属相一致。然而,系统发育树上显示该菌株与最相似菌种形成单独分支,且生理学特性显示出与最相似的3个物种具有明显的差异,包括盐浓度、pH耐受,镁离子需求,H2S产生,淀粉、明胶水解,抗生素敏感性等。另外,杂交结果显示,菌株SCSIO CD13T与最相似菌种Natronococcus jeotgali B1T的杂交值为23%;综合多相分类结果,菌株SCSIO CD13T应为Natronococcus属的一个新成员,将其命名为湛江嗜盐碱球菌新种(Natronococcus zhanjian-gensis),典型菌株SCSIO CD13T。     

基因组改组技术选育耐高温、耐高乙醇酿酒酵母菌株的研究

当以f4、f5、f6作为出发菌株,用酵母菌原生质体紫外诱变的方法,在不同温度下,用含有不同浓度乙醇的平板筛选,分别获得了在耐高温和耐乙醇性状有较大提高的f4.2、f5.1、f6.2、f4.5等正突变菌株。以这些菌株作为出发菌株,进一步用硫酸二乙酯诱变,获得了f5.1.1、f4.2.1两个乙醇耐受性能较高的菌株。在建立了上述不同突变株后,通过基因组改组(genome shuffling)的方法,将上述不同特性的菌株经过两轮genome shuffling,获得了耐高温性能和耐乙醇性能都较好的酵母菌株。经过摇瓶发酵后证明,R24株在35℃发酵过程中,发酵液中的最高乙醇浓度12.93%(W/V),比原始出发菌株f4在35℃的发酵液中最高乙醇浓度8.11%提高了近5%。