酶法生产L-半胱氨酸产酶培养基的研究

目的:找到能够高效合成L-半胱氨酸合成酶的培养基。方法:研究进行了假单胞菌F12在复合培养基和简单培养基合成L-半胱氨酸能力的对比及产酶过程分析。结果:简单培养基生长的菌体合成L-半胱氨酸能力较高,单位菌体产生L-半胱氨酸能力比复合培养基增大1倍;DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)诱导L-半胱氨酸合成酶的产生;葡萄糖的存在不利于产酶,后期酶的比生产速率为-0.11 U/mg DCW·h,对照中为4.04 U/mg DCW·h。结论:以DL-ATC为碳氮源的基本培养基最有利于产酶。     

Pseudomonas sp.F-12发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究

通过不同发酵策略对Pseudomonas sp.F-12以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为底物生产L-半胱氨酸的过程进行优化,以分批发酵和指数流加发酵的形式进行生产,将发酵过程中的DL-ATC浓度分别控制在5 g/L和15 g/L。结果表明15 g/L DL-ATC分批发酵生产L-半胱氨酸得到最高酶活为149.1 U/mL,比活为70.9 U/mg DCW;采用15 g/L DL-ATC两阶段指数流加发酵,可使最高酶活达到313.3 U/mL,提高为分批发酵的2.1倍。同时在两阶段发酵过程中,能减少DL-ATC用量为5 g/L。两阶段发酵过程采用不同流加策略,证明菌体得率对酶活水平有显著影响。首次考察了Pseudomonas sp.F-12全静息细胞转化合成L-半胱氨酸的主要影响因素。结果表明Pseudomonas sp.F-12的最适转化pH为8.0,最适转化温度为30℃。加入甲苯等有机溶剂改变细胞膜通透性,使得半胱氨酸产量比对照组提高7.16倍,最高摩尔转化率达到93.3%。不同金属离子对转化影响不同,0.1 mmol/L Fe2+对转化反应有促进作用,0.1 mmol/L Co2+、Zn2+、Ni2+等重金属离子有抑制作用。研究结果为微生物法发酵及全细胞转化合成半胱氨酸的后续工业化奠定了基础。     

假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸

采用微生物酶转化法制备L-半胱氨酸具有周期短、成本低、区域和立体选择性强、反应条件容易控制、环境友好等特点,与传统的毛发水解以及化学合成工艺相比显示出明显的优越性。本文从假单胞菌产酶条件和酶学性质、DL-ATC生物转化途径、固定化细胞转化工艺、基因工程菌的研究、以及L-半胱氨酸脱巯基酶的研究等5个方面介绍了国内外关于生物转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸的研究进展。     

恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究

对以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid,DL-ATC)为底物原料,经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸,并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究.建立了以恶臭假单胞菌TS1138(Pseudomonas putida TS1138)全细胞为酶源,反复多次催化底物合成L-半胱氨酸,并以2.0%二甲基亚砜(DMSO)为氧化剂氧化生成L-胱氨酸,进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺.采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78.55%,纯度为99.12%.该方法简单高效,解决了酶稳定性差不能重复使用,而固定化酶方法繁琐成本高的问题,为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径.     

微生物酶法合成L-半胱氨酸和L-胱氨酸

从土壤中分离到一株假单胞菌Pseudomonas sp.TS1138菌株,其胞内含有DL-2-氨基-Δ²-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-Amino-Δ²-Thiazoling-4-Carboxylic Acid,缩写为DL-ATC)水解酶,以培养16h的细胞为酶源,可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。该菌株生长及产酶的最佳碳、氮源为葡萄糖和尿素,DL-ATC对酶的产生具有诱导作用。酶促反应后的产物经薄层层析、旋光度法和高效液相色谱鉴定为L-半胱氨酸。     

酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件研究

目的:考察酶源保存方式、酶促反应时间、底物pH值、底物浓度、酶浓度、金属离子等因素对酶活力的影响。方法:以假单胞菌(Pseudomonassp.)TS1138为供试菌株,采用酸式茚三酮法测定L-半胱氨酸含量,研究了酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件。结果:TS1138菌株中L-半胱氨酸脱巯基酶具有较高的活性,而且Mg2 、Mn2 、Fe2 、Zn2 、Cu2 等5种金属离子对DL-ATC水解酶酶系有不同程度的抑制,其中Cu2 对该酶系的抑制作用很大。结论:确定了TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的最适酶促反应条件,为酶促反应动力学的研究奠定了基础。     

恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究

对以DL-2-氨基-?2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-?2-thiazoline-4-carboxylic acid, DL-ATC)为底物原料, 经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸, 并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究。建立了以恶臭假单胞菌TS1138 (Pseudomonas putida TS1138)全细胞为酶源, 反复多次催化底物合成L-半胱氨酸, 并以2.0%二甲基亚砜(DMSO)为氧化剂氧化生成L-胱氨酸, 进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺。采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78.55%, 纯度为99.12%。该方法简单高效, 解决了酶稳定性差不能重复使用, 而固定化酶方法繁琐成本高的问题, 为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径。     

利用指数流加补料高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶重组大肠杆菌

【目的】对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-β-ffase进行高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶工艺研究。【方法】比较溶氧反馈补料和指数流加补料对重组菌发酵产酶的影响,对不同比生长速率和诱导时机进行优化。【结果】确定了双阶段指数流加过程中重组菌生长的比生长速率,分别控制诱导前期比生长速率为0.20 h~(-1),诱导后期比生长速率为0.13 h~(-1),诱导时机为指数中期。获得细胞干重约为51 g/L,最高酶活达到1.79×10~5 U/L,单位菌体产酶量为3 510 U/g,单位产酶速率达到3.58×10~4 U/(L·h),生物量、单位菌体产酶量和产酶速率分别是指数流加未优化前的1.8、1.7和3.0倍。【结论】双阶段指数流加补料工艺能有效提高β-呋喃果糖苷酶的产酶量,为β-呋喃果糖苷酶的进一步工业化奠定基础。     

硫化氢前体L-半胱氨酸对结肠动力的影响及机制

本文旨在研究硫化氢(hydrogen sulfide, H_2S)前体L-半胱氨酸对大鼠结肠动力的影响,以阐明其对结肠收缩的调节作用及机制。采用免疫组织化学染色和免疫印迹实验检测内源性H_2S合成酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)在大鼠近端结肠的表达情况;采用生理记录仪检测结肠平滑肌收缩活动的变化;利用膜片钳实验检测结肠平滑肌细胞离子通道电流。结果显示,CBS和CSE在大鼠近端结肠黏膜层、平滑肌层及肌间神经丛均有表达;L-半胱氨酸以浓度依赖的方式抑制近端结肠纵行平滑肌收缩,H_2S合成酶抑制剂氨基氧乙酸(aminooxyacetateacid,AOAA)和炔丙基甘氨酸(propargylglycine, PAG)孵育纵行平滑肌后,L-半胱氨酸半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect, EC50)相比对照组显著下降(P 0.05);而L-半胱氨酸对结肠环形肌收缩具有抑制和促进双重调节作用,AOAA和PAG预处理可阻断其对环形肌的兴奋作用;H_2S外源性供体Na HS在低浓度时促进平滑肌细胞L型钙通道开放(P 0.01),而在高浓度时抑制L型钙通道电流(ICa,L)(P 0.05);与Na HS不同,L-半胱氨酸浓度依赖性抑制ICa,L (P 0.01);Na HS抑制大电导钙激活钾电流(IBKCa),而L-半胱氨酸对IBKCa无明显作用。以上结果提示,L-半胱氨酸对大鼠结肠平滑肌收缩具有潜在双重调节作用,其中抑制作用由L型钙通道介导,而促进作用可能是由内源性生成的H_2S介导。     

代谢副产物乙酸对L-色氨酸发酵的影响

分析了重组大肠杆菌(E.coli TRTH/pSV-709)发酵生产L-色氨酸的发酵过程,检测结果表明发酵液中有大量代谢副产物乙酸的积累。利用外源添加试验研究了乙酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明乙酸浓度高于2g/L时对L-色氨酸生产菌的生长和产酸均有抑制作用。分析了乙酸的产生机制,并采取了调节溶氧水平、确定合适初始葡萄糖浓度、限制葡萄糖流加及控制菌体比生长速率等措施来减少乙酸的生成。在优化条件下,乙酸含量与原工艺相比降低了51.35%,菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了51.07%和46.54%,实现了高密度发酵培养的目的。     

刺孢小克银汉霉氨基酰化酶拆分DL-丙氨酸的研究

选育了刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)9980菌株,并对其进行液体培养,比较了3种不同培养基中菌体细胞氨基酰化酶活性,考察了几种因素对菌体细胞拆分反应的影响,并对DL-丙氨酸进行了光学拆分。结果表明:蛋白胨培养基菌体细胞酶活最高,达680u/g。菌体细胞拆分反应最适温度55℃,最适pH7.0,最佳底物浓度为0.2mol·L-1,缓冲体系中的无机离子对拆分反应有抑制作用,10-3～10-4mol·L-1的Co2+对拆分反应有激活作用。用菌体细胞对DL-丙氨酸拆分反应中,D-丙氨酸得率平均达87.1%。     

重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略

重组Pichia pastoris GS115表达碱性果胶酶的诱导阶段, 最佳初始菌体浓度和甲醇诱导浓度分别为122 g/L和20 g/L, 两者之间最佳比值范围是0.16~0.20 g/g (甲醇/菌体浓度). 在此基础上通过生长阶段甘油的指数流加, 以及诱导阶段基于甲醇比消耗速率和溶氧等参数进行甲醇流加的方式, 将甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195 g/g之间. 此时, 酶活达到430 u/mL, 生产强度为4.34 u/mL/h, 实现了碱性果胶酶高效生产。     

阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶的基因克隆及重组酶性质分析

为研究重组阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶的活性,从阴道毛滴虫提取RNA,经过RT-PCR克隆蛋氨酸γ-裂解酶基因,与pET-15b质粒连接构建原核表达载体pET-15b-mgl1,并测序。转化宿主菌BL21后进行诱导表达,分离纯化目的蛋白并研究其酶学性质。以L-蛋氨酸、DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸为底物测定重组酶Km值为0.318、2.14、1.62mmol/L,比活性分别为20.17、318.69、56.96μmol/min/mg protein。MGL最适pH在5.0到6.0之间,在50℃可稳定30min无活性损失。实验结果显示重组酶具有较高的活性和较好的热稳定性,为临床应用研究奠定基础。     

重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略

重组Pichia pastoris GS115表达碱性果胶酶的诱导阶段, 最佳初始菌体浓度和甲醇诱导浓度分别为122 g/L和20 g/L, 两者之间最佳比值范围是0.16~0.20 g/g (甲醇/菌体浓度). 在此基础上通过生长阶段甘油的指数流加, 以及诱导阶段基于甲醇比消耗速率和溶氧等参数进行甲醇流加的方式, 将甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195 g/g之间. 此时, 酶活达到430 u/mL, 生产强度为4.34 u/mL/h, 实现了碱性果胶酶高效生产。     

H2S介导ABA诱导蚕豆气孔运动的生理机制研究

以蚕豆为实验材料,利用药理学实验和分光光度法,研究了ABA处理及ABA与H2S合成抑制剂共处理对蚕豆气孔运动的影响,以及体内H2S水平、H2S合成酶L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(磷酸吡哆盐依赖性酶)活性变化.结果表明:(1)光下H2S的合成抑制剂羧甲氧基胺半盐酸盐(AOA)、羟氨(NH2OH)、L-/D-半胱氨酸脱巯基酶分解产物C3H3KO3+NH3均明显抑制ABA诱导的蚕豆气孔关闭;(2)外源ABA能够明显提高叶片的H2S水平及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性;(3)AOA、NH2OH、C3H3KO3和NH3均可以逆转ABA所引起的H2S水平及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的升高.研究发现,ABA可通过增强L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性,促进L-/D-半胱氨酸分解生成H2S,进而诱导蚕豆气孔关闭.     

吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的补料研究

在吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分批发酵研究的基础上,通过在菌体生长阶段指数流加葡萄糖,进行高细胞密度培养,获得了较高的菌体量;待菌体生长进入产酶期后,通过补加氮源,为产酶提供充足的氮源,其中通过流加蛋白质氮源,可以减少蛋白酶对成熟MTG的分解,促进产酶。结果表明,8~16 h采用较高的的比生长速率(0.15 h-1),后期降低比生长速率(0.10 h-1),此时得到的菌体量较高,可达到36 g/L,比分批发酵下的菌体量提高了80%。同时在培养基中添加50g/L的豆饼粉,最终酶活可达到5.79U/ml,提高了83%。     

pH两阶段控制策略发酵生产重组角质酶

为提高基因工程菌Bacillus subtilis WSHB06-07发酵生产角质酶的产量和生产强度,考察了pH（5.5~8.0）对菌体生长和产酶的影响。基于不同pH发酵过程中菌体比生长速率及比产物合成速率的变化,确定了pH两阶段控制策略,即0~4 h时控制pH 7.5,4 h后将pH调至6.5。通过采用这一优化策略,角质酶酶活有了较大的提高,达170 U/mL,生产强度为16.9 kU/(L·h),比恒定pH 7.5控制模式下分别提高了122.6%和123.2%。     

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。     

假单胞菌生物合成L-半胱氨酸途径中脱巯基酶的研究

通过PCR方法扩增得到假单胞菌TS1138L-半胱氨酸脱巯基酶基因（cd）,将其克隆至pBlueseript SKII载体,测定了含有L-半胱氨酸脱巯基酶基因的1．2kbDNA片段序列,并与其它菌株的脱巯基酶基因进行了同源性比较;同时,将其克隆至表达载体pET-21a（＋）,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA柱亲合层析后,得到纯化的重组蛋白。利用脱巯基酶的活性染色方法对重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶进行了鉴定,并探讨了L-半胱氨酸脱巯基酶的酶学性质,以及在生物转化合成L-半胱氨酸途径中的关键作用。     

甲硫氨酸γ-裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性

【背景】为了开发海洋蕴藏的新型微生物资源,本研究团队采用不依赖培养的宏基因组技术,构建了深海宏基因组文库,并对其中的重要基因进行后续研究。【目的】使用来自深海宏基因组文库中的甲硫氨酸γ-裂解酶基因(mgl)在大肠杆菌中高效表达并对其活性进行检测。【方法】将mgl基因克隆到表达载体pET-28a(+)并转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并对表达条件进行优化,获得甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionine-lyase,r MGL)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白r MGL,大小与预测的46 kD相符合,并具有很高的裂解L-甲硫氨酸的活性。r MGL能催化L-甲硫氨酸和DL-同型半胱氨酸的裂解,但几乎不作用于L-半胱氨酸和L-胱氨酸,其中对DL-同型半胱氨酸的催化效率比对L-甲硫氨酸的催化效率高,相对活性约为对L-甲硫氨酸催化效率的1.4倍。【结论】来自深海宏基因组文库中的mgl基因能够利用p ET-28a(+)/BL21(DE3)高效表达r MGL。