sTRAIL基因的表达、纯化及其生物学活性的初步研究

在原核表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(sTRAIL)分子,纯化表达产物,并进行初步的生物学活性的研究中,通过提取外周血淋巴细胞总RNA进行RT—PCR克隆sTRAIL cDNA,构建sTRAIL的原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,IPTG诱导表达。以发酵罐放大培养,SDS-PAGE和Western-blot确认表达,用亲和层析和阳离子层析纯化表达产物,使用L929、Qay肝癌、K562人白血病等肿瘤细胞鉴定活性。结果发现重组表达的sTRAIL融合蛋白占总蛋白的39％,单纯蛋白纯化后纯度达95％,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL分子,能诱导几株肿瘤细胞凋亡。原核表达系统正确表达了TRAIL分子,并摸索了中试生产的条件,为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

TRAF6-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与GST的融合蛋白并进行纯化。方法:采用PCR方法从肝文库中扩增编码TRAF6的DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST-TRAF6原核表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST-TRAF6融合蛋白。结果:酶切鉴定和测序分析显示,长为1569 bp的TRAF6 DNA片段在pGEX-4T-2-TRAF6中的碱基序列、插入位点及读框正确,且位于表达载体的GST序列下游;经IPTG最佳浓度0.5 mmol/L诱导表达、亲和纯化后,获得了相对分子质量约85×103的GST-TRAF6融合蛋白。结论:构建了重组GST-TRAF6原核表达载体,获得了GST-TRAF6的大肠杆菌BL21表达菌株及GST-TRAF6融合蛋白,利于深入研究TRAF6的功能。     

鲍曼不动杆菌MsrA蛋白原核表达载体的构建、纯化及氧化应激条件下的表达

目的以鲍曼不动杆菌甲硫氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)构建p ET28a-MsrA并表达、纯化原核表达重组质粒,观察在氧化应激条件下MsrA的表达水平,为其抗氧化功能的研究提供依据。方法设计并合成分别带NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的MsrA引物,用PCR方法扩增MsrA基因,构建p ET28a-MsrA重组质粒并转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组MsrA蛋白表达,经Ni2+亲和层析分离纯化。利用荧光定量PCR方法,观察在氧化应激条件下MsrA蛋白的表达量。结果构建了编码MsrA蛋白的重组质粒p ET28a-MsrA,SDS-PAGE显示在相对分子质量约22 000处有一明显条带的重组MsrA蛋白,并利用Ni2+亲和层析柱纯化获得纯度较高的MsrA蛋白。氧化应激也可快速诱导MsrA蛋白的表达。结论成功构建了p ET28a-MsrA重组质粒及表达纯化系统,且氧化应激条件下MsrA蛋白表达上调。     

GST/ AEP 融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定

目的：为进一步研究抗癫痫肽（And—epilepsy peptide,AEP）的抗痫机制及筛选其相关作用蛋白,进行GST／AEP融合蛋白原核表达载体的构建及融合蛋白的表达。方法：通过PCR基因扩增对AEP基因进行扩增,并将其克隆于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）,经IPTG诱导获得表达,并采用Western Blot进行检测。结果：成功构建了AEP原核表达载体,并在大肠杆菌B121中获得表达。结论：成功构建了GST／AEP原核表达载体,并表达了GST／AEP融合蛋白。     

重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

可溶性人TNFR75的表达、纯化及活性鉴定

将编码可溶性人TNFR75 (shTNFR75 )的cDNA与酵母整合载体pPICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞GS 115 ,获得了shTNFR75在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .甲醇诱导的pPICZαA shTNFR75 GS115重组酵母工程细胞培养上清 ,经CNBr活化的TNF Sepharose4B亲和层析柱纯化 ,纯化产物纯度为 92 % ;经Western印迹分析 ,可被TNFR75单克隆抗体特异性识别 ,分子量约为 31kD ;受体配体结合试验 ,shTNFR75纯化产物与rhTNFα和rhTNFβ的结合能力与其阳性对照基本相同 ;中和试验显示 ,该shTNFR75可完全阻断TNF对L92 9细胞的细胞毒活性 .表明酵母系统分泌表达的shTNFR75产物具有良好的结合TNF的能力 .     

利用套叠PCR技术改造人可溶性TRAIL cDNA片段及真核表达载体的构建

利用套叠PCR技术对可溶性TRAIL基因片段(sTRAIL,114aa-281aa)的“KEX2”位点及“ATTTA”位点分别进行改造,并构建真核表达载体;结果表明:成功获得了3种突变基因:sTRAILK、sTRAILA以及sTRAILAK,并成功构建了4种分泌型酵母表达载体:pPICZα-A-sTRAILK,pPICZα-A-sTRAILA,pPICZα-A-sTRAILAK以及pPICZα-A-sTRAIL.     

人CXCL4蛋白原核表达与纯化

CXCL4又名血小板因子4(PF4),属于CXC趋化因子亚家族,能够广谱的作用于多种细胞,在炎症,凝血等众多生理及病理反应中发挥重要作用。将CXCL4全长基因构建到原核表达载体pET43.1a(+),利用大肠杆菌系统表达,继而纯化获得高纯度的目的蛋白。实验表明重组人CXCL4蛋白可以有效抑制人肾癌细胞增殖,具有生物学活性。重组人CXCL4原核表达与纯化方法的建立将有助于其生物学结构与功能的研究,并且对趋化因子家族其它蛋白质的表达与纯化具有参考价值。     

东方马脑炎E2蛋白原核表达及免疫活性初步研究

为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆、表达和活性测定

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 ,重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆与表达

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ,ＴＲＡＩＬ）是新近发现的肿瘤坏死因子家族成员,亦称凋亡素２配体（Ａｐｏ２ｌｉｇａｎｄ,Ａｐｏ２Ｌ）［１,２］．由于ＴＮＦ参与机体的免疫调节和炎症反应,并发挥细胞毒作用,因而为世人所瞩目［３,４］．研究表明,ＴＲＡＩＬ与ＴＮＦ和Ｆａｓ／Ａｐｏ１配体一样,为典型的Ⅱ型跨膜蛋白,Ｃ端细胞外区域形成同源三聚体的亚结构,而Ｎ端１５～４０氨基酸为疏水区域并形成跨膜结…     

人TRAIL 基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段(114～281氨基酸残基)并构建原核表达载体。方法:取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果:从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论:成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

人TRAIL基因原核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因片段（114～281氨基酸残基）并构建原核表达载体。方法：取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果：从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论：成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

S100A4原核表达载体的构建以及蛋白的表达和纯化

S100A4是S100蛋白家族的成员,在细胞的增殖、分化、损伤修复以及肿瘤细胞转移等方面发挥重要的调控作用.本研究将S100A4全长基因构建到pET28a原核表达载体上,利用大肠杆菌表达系统表达和纯化出高纯度的重组人S100A4.通过试验证明,重组人S100A4蛋白在体外可以有效地增强黑色素瘤细胞A375-S2的增殖.重组人S100A4原核表达与纯化方法的建立将促进其结构和生物学功能研究,并且对于S100蛋白家族其它蛋白的表达与纯化具有重要的参考意义.     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。