深绿木霉中碳代谢抑制因子CRE1功能特性研究

木霉菌(Trichoderma spp.)是一种广泛存在于土壤及植物根系生境中的丝状真菌,具有拮抗植物病原真菌和促进植物生长的双重功效。碳代谢抑制子CRE1全局性调控细胞生长代谢过程,保障木霉在不同生境中的存活及拮抗病原菌特性。比较深绿木霉(T.atroviride)T23及其Cre1突变株(T23Δcre1)在不同培养基中的生长和代谢特性,结果表明:cre1基因沉默后,T23Δcre1较T23菌丝生长变慢,产孢滞后且降低一个数量级,cre1对菌丝生长和产孢的调控依赖于培养基组分。此外,cre1基因抑制几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶基因转录,区别性调控部分次级代谢合成的非核糖体肽合成酶NRPS和聚酮合成酶PKS基因的表达。综上,碳代谢因子CRE1作为一个多效性的转录调控因子,抑制细胞壁降解酶和代谢产物合成相关的基因表达,赋予木霉菌在环境中的适应性和竞争性,是深绿木霉T23生长的必要因子。     

根癌农杆菌介导深绿木霉高产漆酶菌株的构建和筛选

利用根癌农杆菌介导技术(ATMT)转化深绿木霉(Trichoderma atroviride)T23,共获得6个稳定的转化子。利用愈创木酚法对转化子进行筛选,发现3株转化子产漆酶能力显著高于出发菌株T23。在限碳培养基中,转化子TA5的漆酶酶活为25.3U/ml显著高于发菌株。研究发现TA5所产漆酶较适宜酸性条件,当pH为3.5时,漆酶活性最高。在温度为18℃时,漆酶活性最高。     

农杆菌介导的绿木霉遗传转化及重寄生缺陷突变体的筛选

绿木霉(Trichoderma virens)是一种重要菌寄生真菌,该菌已广泛应用于多种病害的生物防治上。本研究构建了双元载体pCATPH-I(GenBank登录号为：KC252999),并利用该载体成功实现了农杆菌介导的绿木霉遗传转化,转化效率可达385~460个转化子/106绿木霉分生孢子。转化子的PCR和遗传稳定性分析表明, T-DNA已整合进该菌的基因组中且在无选择压力的条件下能够稳定遗传。利用该转化体系成功建立了超过2000个转化子的转化子库,通过转化子与病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)对峙培养在该转化子库中成功筛选到两个重寄生缺陷突变体,D441和A281。本研究的完成可为绿木霉的功能基因组学及重寄生分子机制的研究打下基础。     

根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展

木霉作为土传植物病原菌的生防真菌,研究其功能基因具有重要的意义。根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。对根癌农杆菌介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。     

农杆菌介导生防棘孢木霉菌转化体系的优化

目的:实现棘孢木霉菌T4的遗传转化并优化其转化体系.方法:以潮霉素抗性为选择标记,利用农杆菌转化法介导转化棘孢木霉菌.结果:潮霉素基因成功整合到受体菌基因组中,转化子抗性基因可稳定遗传.结论:最优的转化体系和条件为:IM和CM培养基中AS浓度为200 μg/mL,棘孢木霉T4孢子浓度为106/mL,农杆菌浓度为200 μL( OD600约0.8),共培养时间为48 h,转化效率约为50个转化子/106个孢子.     

农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中的应用与展望

综述农杆菌介导法在巴西橡胶树遗传转化中的应用进展,分析影响农杆菌转化的关键因素,如植物基因型与外植体、菌株与载体类型、菌液浓度与侵染时间、vir诱导物、筛选剂与抑菌剂、培养基的组成和附加成分等,并对提高巴西橡胶树转化效率的策略进行探讨。     

HPT-mCherry融合标签在水稻转基因筛选鉴定中的应用

目的：利用HPT-mCherry融合标签加速转基因筛选过程。方法：构建HPT-mCherry融合表达载体,采用农杆菌介导的转基因技术获得转基因植株,并利用荧光显微镜观察转基因愈伤和植株。结果：HPT-mCherry融合标签可用于转基因愈伤的筛选和转基因植株的鉴定;HPT与mCherry融合后互不影响,一方面可利用潮霉素抗性筛选愈伤,另一方面能通过观察mCherry红色荧光蛋白进行鉴定。结论：利用HPT-mCherry融合标签可以快速有效地鉴定并得到转基因阳性植株。     

LeCOP1LIKE基因的克隆、反义构建及微型番茄的转化

本文报告利用EST筛选结合RT-PCR的方法从番茄中克隆了LeCOP1LIKE基因的1060bpcDNA片段,并利用其非保守域构建反义RNA表达载体。利用农杆菌介导法．将LeCOP1LIKE基因的反义RNA表达载体转入微型番茄Micro-Tom．获得了10株反义LeCOP1LIKE转基因微型番茄。RT-PCR分析表明其中4个转基因株系中的LeCOP1LIKE表达被显著抑制．并发现抑制LeCOP1LIKE基因的表达导致转基因番茄的株高下降、叶片的叶绿素含量提高、果实中番茄红素含量增加,并且明显抑制转基因种子的发育。这些实验结果证明了LeCOP1LIKE基因为番茄发育过程中光形态建成的抑制因子。     

根癌农杆菌介导法在禾本科植物遗传转化中的应用

在植物基因工程中,农杆菌质粒介导的遗传转化是比较完善与有效的基因转移方法,但在单子叶植物中应用较少。文章介绍了农杆菌介导遗传转化技术在禾本科植物改良中的研究进展,并对此法的应用前景作了分析。     

拟南芥植物硫肽激素基因在玫瑰茄细胞中的表达

利用玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系,通过根癌农杆菌将AtPSK2基因导入玫瑰茄细胞,并获得了功能性表达。研究结果表明,所获得的转基因玫瑰茄细胞系的临界植板细胞密度和临界起始细胞密度分别降低了60%和50%,悬浮细胞培养周期由16d缩短到12d,转化愈伤组织的比生长速率比对照提高了75%,转基因玫瑰茄细胞和愈伤组织中的花黄素含量与对照相比没有发生明显变化。本研究所获得的转基因玫瑰茄细胞系不仅为花青苷和花黄素等次生代谢产物高产细胞株的选育提供出发材料,而且为PSK-α作用机理的深入研究提供一个有用的模型。     

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of the Vegetative Dikaryotic Mycelium of the Cultivated Mushroom Flammulina velutipes

Agrobacterium tumefaciens was used to transform the vegetative dikaryotic mycelium of Flammulina velutipes using a hygromycin B resistance gene as selectable marker. The gene coding for urogen III methyltransferase (cob) was introduced into F. velutipes dikaryotic cells. The resulting transformant cells generated a bright red fluorescence, indicating that cob is promising as a reporter gene in F. velutipes.     

影响根癌农杆菌介导的木霉菌遗传转化因素分析

采用根癌农杆菌介导的转化方法,以木霉菌分生孢子为受体材料,对影响转化效率的主要因素进行了分析。结果表明,农杆菌菌株类型、初始菌液量、分生孢子浓度、共培养时间以及乙酰丁香酮的诱导等因素对转化效率都具有重要的影响。通过对这些因素的分析,基本得出了根癌农杆菌转化系统对木霉菌遗传转化的特点和规律,为将该转化系统用于其它丝状真菌的遗传转化提供了重要参考。     

农杆菌介导单子叶植物基因转化研究进展

农杆菌介导基因转化系统是双子叶植物基因转化的普通而有效的手段, 其优点倍受重视,近年来又广泛用于曾被认为不在农杆菌宿主范围之内的单子叶植物的基因转化研究,并在很多重要粮食作物上获得成功,例如水稻、玉米、大麦、小麦等。本文就农杆菌转化的优点,转化机理以及对单子叶植物转化的研究进展作一概述     

利用根癌农杆菌T-DNA 插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因

【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation,ATMT)建立一个容量约200000的随即插入突变文库,在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern确定突变株中T-DNA的拷贝数,利用反向PCR获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30株葡萄糖去阻遏突变株,Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10个不同生物学功能基因,如参与碳水化合物的代谢,固醇的合成,几丁质的合成,GPI脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因,为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆酶活性提供参考。     

农杆菌介导的获取疏绵状嗜热丝孢菌插入突变体体系的建立

[目的]建立疏绵状嗜热丝孢菌的稳定遗传转化体系并获得插入突变体.[方法]利用农杆菌介导的方法建立疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系 ;分别通过Southern杂交、克隆转移DNA(T-DNA)侧翼序列来确定T-DNA在疏绵状嗜热丝孢菌基因组中的拷贝数和插入位点.[结果]成功建立了可靠的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系.共培养过程中使用萌发孢子是成功建立疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的必要条件.疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌在28℃共培养48h时,转化效率最高.乙酰丁香酮(AS)在农杆菌预培养及疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌的共培养阶段都是必需的,且在共培养阶段当AS浓度为500 μM时转化效率最高.Southern杂交验证表明,79.2％的转化子为T-DNA单拷贝插入,且通过热不对称PCR (TAIL-PCR)分析得出T-DNA在该菌基因组中的插入位点是随机的.通过该转化系统筛选到部分表型突变体.[结论]我们首次报道了利用ATMT技术成功转化嗜热真菌-疏绵状嗜热丝孢菌,证明了该方法是一种简单有效的获得插入突变体的方法,并为该嗜热真菌进行基因定位提供了工具.     

农杆菌介导SsNHX基因转化中林美荷杨的研究

方法:以中林美荷杨组培苗的茎段为转化受体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将盐地碱蓬(Suaedaheteroptera)的Na /H 反向运输体基因SsNHX导入中林美荷杨组培苗中,实验过程中对影响遗传转化的一些关键因素进行了筛选研究。结果:最佳浸染条件为茎段外植体预培养1d,菌液浓度OD6000.3,浸染时间15-30min,共培养时添加AS 200μmol/L。经过抗性植株的PCR检测证明外源基因SsNHX已整合到中林美荷杨基因组中,获得了抗卡那霉素的再生植株及PCR阳性植株。结论:初步建立了中林美荷杨的遗传转化体系,为其遗传转化培育出抗盐碱的转基因植株奠定了理论基础。