小鼠腹水型肝癌H22a细胞浆胞内磷蛋白磷酸酶的纯化和性质

 磷蛋白磷酸酶是磷酸化/脱磷酸化作用中重要的调节酶。本文建立了小鼠腹水型肝癌细胞胞浆内磷蛋白磷酸酶(PrP)的纯化方法。用~(32)P-酪蛋白为底物测定活力。经纯化的酶纯度提高1380倍,聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检查,只有一条泳带。用凝胶过滤法和聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测得该酶分子量为200,000。该酶催化~(32)P-酪蛋白脱磷酸化反应的最适pH7.2,对热不稳定。     

小鼠腹水型肝癌H22a细胞浆内磷蛋白磷酸酶活力调节的研究

小鼠腹水型肝癌细胞胞浆内磷蛋白磷酸酶对磷酸化的组蛋白、酪蛋白、鱼精蛋白具有脱磷酸化活力,而对小分子底物P-Ser、P-Thr、P-Tyr、PNPP等无活力。二价金属离子Mn~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)对酶有明显激活作用,而Zn~(2+)、F~-、Pi对酶有明显抑制作用。代谢中间物G-6-P、G-1-P、F-6-P、F-1.6-2P、ATP、ADP、GTP对酶有抑制作用,而磷酸化氨基酸和环核苷酸对酶活影响很小。还试验了碱性蛋白质和酸性蛋白质对酶活力的影响,肝素和组蛋白均对酶活力有抑制作用,当两者混和后,其抑制作用会相互抵消。     

小鼠再生肝胞浆磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化和性质研究

以~(32)P(Tyr)-Poly Glu,Tyr(4:1)为底物,用于研究小鼠再生肝胞浆磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)的分离纯化和性质。再生肝胞浆经60％饱和度硫酸铵盐析,二次DEAE纤维素层析,Sephadex G-200柱层析和Poly Glu,Tyr-Sepha-rose 4B亲和层析后,得到的PTPP分子量为67000,纯度提高1123倍,活性回收率为28％,对~(32)P(Tyr)-Poly Glu,Tyr有很高的活力,对~(32)P(Ser/Thr)-Casein(酪蛋白)和PNPP(对硝基苯酚磷酸盐)没有作用,其最适pH为6.8～7.1,对热不稳定。EDTA对酶有激活作用,Zn~(2+)、PNPP、P-Tyr、多胺化合物、焦磷酸根、钼酸根、柠檬酸根对酶有明显的抑制作用。酶对Na_3VO_4不敏感。碱性蛋白质组蛋白、鱼精蛋白对酶活力有抑制作用,酸性蛋白质酪蛋白和酸性多糖物质肝素对酶活力有激活作用,且后者能减弱前者的抑制作用。     

突触中磷蛋白的生后发育变化

为了研究在突触功能中起重要作用的磷蛋白状况,利用高分辩率的放射自显影、梯度电泳和双向电泳,以及抗ＣａＮ多克隆抗体封闭ＣａＮ磷酸酶活力等技术,并运用计算机图象处理系统,对大鼠大脑皮层突触体中磷蛋白生后发育变化进行定量分析．结果表明,大鼠出生后（ＰＮＤ）３ｄ、７ｄ、２１ｄ、和成年磷蛋白表达有很大不同,在出生后早期对应突触主要形成时期,磷蛋白呈高表达;从ＰＮＤ２１ｄ开始至成年,底物蛋白磷酸化状态逐渐降低,同时研究了突触主要形成时期有显著变化的钙调神经磷酸酶,它的内源底物及其在其生后发育所发生的变化．     

罗非鱼鱼皮酶解液对体外培养大鼠骨髓基质细胞的影响

目的:观察两种罗非鱼鱼皮酶解液对大鼠骨髓基质细胞的影响。方法:用密度梯度离心和贴壁筛选的方法获得骨髓基质细胞,用碱性磷酸酶染色法观察是否成功诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化,并分别采用MTT法和PNPP法测定两种酶解液对骨髓基质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。结果:密度梯度离心和贴壁筛选可得到较为均一的骨髓基质细胞。这些骨髓基质细胞诱导后可以向成骨细胞分化。两种酶解液作用于骨髓基质细胞时,在浓度0.1mg·ml~(-1)均可以促进骨髓基质细胞增殖,在浓度0.1mg·ml~(-1)1,0.01mg·ml~(-1)均可以提高骨髓基质细胞碱性磷酸酶活力。实验用两种酶解液的三个浓度与成骨诱导液协同作用于骨髓基质细胞时,均没有促进细胞增殖和提高碱性磷酸酶活性的显著作用。结论:两种酶解液可以促进骨髓基质细胞增殖,提高细胞碱性磷酸酶活力;与成骨诱导液协同作用于骨髓基质细胞时,对细胞增殖和碱性磷酸酶活性没有显著促进及提高作用。     

黄鳝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液(pH8.6)抽提,正丁醇处理,30%-75%硫酸铵分级沉淀分离,DEAE-Sepharose离子交换柱层析,Sephacryl S-200凝胶过滤纯化,从黄鳝内脏组织中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶。该酶提纯倍数为564倍,比活力达到3015U/mg。酶学性质和动力学性质研究表明,该酶催化磷酸苯二钠的水解反应,最适pH值为10.2,pH小于7和大于12均不稳定;最适温度为40℃,温度高于50℃不稳定;米氏常数Km值为1.17mmo1/L。金属离子对该酶的催化活力有不同的影响,K+对该酶活力无影响,Mg2+对该酶有激活作用,Zn2+对该酶有抑制作用。       

鲫鱼酸性磷酸酶酶学特性及不同效应物对酶活力的影响

经NaAc-HAc缓冲液(pH5.0)抽提,正丁醇处理,硫酸铵分级沉淀,DEAE-32离子交换层析,SephadexG-150凝胶过滤纯化,从鲫鱼内脏中分离纯化出电泳纯的酸性磷酸酶。该酶提纯倍数为30.82,比活力195.06U/mg。研究表明,该酶催化对硝基苯磷酸二钠水解反应,最适pH4.8,pH小于4和大于7时不稳定;最适温度45℃,温度高于50℃不稳定;米氏常数为0.23mmol/L,利用SDS-PAGE测定酶亚基分子量为33.3kD。化学修饰剂SUAN、PMSF、DTT、NBS对该酶活力影响不大,BrAc和IAc有明显抑制作用。金属离子对该酶催化活力有不同影响,Na+、K+、Ni2+、Co2+影响不显著,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+有激活作用,Ag+、Cu2+、Pb2+、Cd2+有抑制作用,其中Mg2+、Ca2+、Pb2+、Cd2+对鲫鱼酸性磷酸酶荧光光谱的影响表明金属离子对酶活力的影响与酶构象改变有关。       

一种适用于双向电泳的水稻磷酸化蛋白富集方法——酚提取法结合固相金属离子亲和层析法

磷蛋白在植物信号传导和胁迫响应中有着非常重要的作用,磷蛋白质组学研究已经成为蛋白质组学研究领域中备受瞩目的一个部分．本研究用酚提取法以水稻日本晴苗期叶片为材料提取叶片总蛋白,提取率达3.5%;用固相金属离子亲和层析柱纯化富集磷蛋白,得到磷蛋白占总蛋白约6.4%．对过柱洗涤液、不同阶段洗脱液等各个组分进行SDS-PAGE,粗略检测其蛋白含量,并根据单向SDS PAGE结果对总蛋白、高峰段磷蛋白、非高峰段磷蛋白以及富集后再纯化的总磷蛋白进行双向电泳,比较其中的蛋白差异．本研究提出的方法和程序可在7 cm聚丙烯酰胺凝胶上检测到多达856个磷蛋白,是一种非常有效的磷蛋白富集、纯化和分离鉴定的方法．     

荧光底物在酶联免疫吸附试验中的应用

碱性磷酸酶底物,对硝基酚磷酸二钠(PNPP),在酶联免疫吸附试验(ELISA)中已普遍使用。本实验用一种荧光底物,4-甲基聚缴花酮磷酸酯做间接ELISA反应(FS-ELISA),同前者进行了比较。当用0.1ml的黄瓜花叶病毒(CMV),浓度为0.1ng/ml包被时,在紫外光下仍可看到反应所产生的荧光。FS-ELISA对CMV测定的敏感度比用PNPP底物时高100倍。最后对该方法用于定性和半定量检测抗原的问题进行了讨论。     

PP2A的结构和功能新进展

PP2A是一种丝／苏氨酸磷蛋白磷酸酶,通过可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白质脱磷酸,在信号传导中承担负性调节的作用。由一个催化亚基和两个调节亚基构成。：PP2A是一种多功能性酶,底物为众多体内的转录因子和蛋白激酶;酵母,果蝇和小鼠的动物模型的研究中已经发现PP2A在细胞周期调控,形态以及发育中的作用;同时它又在信号转导的级联反应中与其他磷酸化酶和激酶相互作用,构成调节大分子调控下游信号的转导。催化亚基活性主要由转录后水平磷酸化和甲基化的状态调控。