信使核糖核酸5′末端帽状结构和功能

信使核糖核酸(mRNA)5′末端帽状结构是病毒mRNA和真核细胞mRNA的重要修饰之一。1974年Reddy在研究Novikoff肝瘤细胞时首先发现细胞核的一种低分子量RNA5′末端具有封闭的帽状结构,其特点是2,2,7-三甲基鸟苷由5′-5′焦磷酸连接于2′-邻甲基腺苷。此后,陆续证实帽状结构存在于多种病毒mRNA和真核细胞mRNA中,并对其结构、功能和合成进行了大量研究。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

运用反转录-PCR技术,从黑色素瘤细胞中扩增出t—PA cDNA 5′末端460bp的片段,再经重组获得含完整5′-UTR的t—PA cDNA克隆,在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达发现,t—PA mRNA 5′—UTR对其表达有明显的抑制作用。将t—PA mRNA 5′—UTR用苜蓿病毒RNA 5′—UTR替换,使t—PA的表达水平提高3-7倍,mRNA翻译起始区二级结构分析结果表明,翻译起始区的二级结构与t-PA的表达水平有关。     

RtcB功能的研究进展

RtcB是后生动物中一种重要的RNA连接酶,能完成2′,3′-环磷酸酯和5′-羟基末端的连接。在tRNA的成熟和XBP1 mRNA的剪接中起着重要的作用。它可以连接tRNA成熟过程中产生的2′,3′-环磷酸末端和5′-羟基末端,从而产生成熟的tRNA。另外,可以连接XBP1前体mRNA产生成熟的XBP1 mRNA,调节UPR反应,从而维持内质网稳态。另外,RtcB对动物胚胎发育和抗体分泌具有重要调节作用,并且与多种神经性疾病的发生密切相关。本文将对RtcB的发现、连接酶功能以及生理功能进行综述,为以后更好地研究其功能及相关机制打下基础。     

一个编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的拟南芥基因的克隆及其在胁迫条件下的表达分析

以对照和盐处理的拟南芥幼苗为材料,利用mRNA差异显示技术筛选得到一个受盐诱导的的3′端cDNA部分序列,其相应的基因AtITL1编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物.Northern blot分析表明,该基因除受盐诱导外,还受低温诱导,但几乎不受干旱和ABA诱导.分析AtITL1基因的5′区发现存在对渗透及低温胁迫起反应而对ABA不起反应的DRE/CRT顺式作用元件.这些研究表明,编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的拟南芥基因可能参与了ABA不依赖的胁迫信号传递途径.     

一个编码1，3，4—三磷酸肌醇5／6激酶类似物的拟南芥基因的克隆及其在胁迫条件下的表达分析

以对照和盐处理的拟南芥幼苗为材料,利用mRNA差异显示技术筛选得到一个受盐诱导的3′端cDNA部分序列。其相应的基因AtITL1编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物。Northem blot分析表明,该基因除受盐诱导外,还受低温诱导,但几乎不受干旱和ABA诱导,分析AtITL1基因的5′区发现存在对渗透及低温胁迫起反应而对ABA不起反应的DRE/CRT顺式作用元件。这些研究表明,编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的拟南芥基因可能参与了ABA不依赖的胁迫信号传递途径。     

稀有的黑檀体基因(ebony)5'UTR自发突变导致黑腹果蝇的黑条体突变

由于果蝇Drosophila群体中有很多自发突变其中包括多种体色突变,因此它是一个研究自发突变的优秀的模式体系。本研究证实我们实验室发现的一个可以引起果蝇体色突变的自发突变(bsr)是一个黑檀体(e)的等位基因,将其命名为ebsr。序列分析显示ebsr的5′端缺失了953个碱基,其中包括外显子1后端的206个碱基及相连的内含子1的747个碱基。逆转录PCR结果显示5′端的缺失导致内含子1不能从mRNA中剪接掉,由此导致该mRNA的翻译起始密码子AUG前端增加了一个3.2kb的序列。该序列导致ebsr的mRNA的5′UTR(5′-untranslated region)区较野生型基因增加近3kb的长度。通过mRNA二级结构分析发现这个增加的3kb的片段可以形成复杂的颈环结构(stem-loop)。免疫印迹结果显示该突变基因没有基因产物产生。本研究进一步证实了由于mRNA的5′UTR序列结构的改变可以影响到蛋白质的翻译。     

鉴定9个新的RHD基因mRNA可变剪接体

为了研究各种RHD基因mRNA可变剪接体的基因结构, 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常人脐血样本RHD mRNA, 对RHD cDNA进行TA克隆和序列分析, 对各可变剪接体的剪接位点进行DNA序列分析, 并将RHD mRNA进行表达序列标签(ESTs)分析。结果在28个阳性克隆中, 除全长RHD cDNA外, 共检测到12种(包括9种新的)RHD可变剪接体, 发现外显子遗漏、5′和3′剪接位点变异3种剪接形式, 涉及外显子2~9, 其中6种新的剪接体同时存在RHD和RHCE基因同源杂交现象。ESTs分析还检索到内含子保留形式的剪接体。研究表明, RHD基因mRNA存在复杂的可变剪接机制, 除已报道的剪接体外, 检测到9种新的RHD可变剪接体, 并发现了可变剪接和同源杂交并存现象。     

微生物产生的冷休克蛋白研究进展

冷休克蛋白(cold shock protein,Csp)首先在大肠杆菌中发现,它与微生物对冷环境的适应及多种细胞功能有关。冷休克蛋白基因是一段编码70个左右氨基酸的DNA序列,在这段序列中有5′非翻译区(5′UTR)、冷盒及下游盒等特征。冷休克蛋白作为DNA或RNA结合蛋白在基因表达调控过程中起重要作用。冷休克蛋白在转录、mRNA稳定性及翻译等几个水平上被严格调控。     

锥虫线粒体中mRNA的编辑

各种 RNA 的成熟过程都要经过一些特殊的加工反应,由于 mRNA 具有传递遗传信息的作用,所以 mRNA 的成熟过程就更加引人注目。其间发生5′端加帽和3′端多聚腺苷酸化反应,内含子则通过剪接机制被删除。但这些都不会改变 mRNA 的编码信息。而近年来的研究发现,在 mRNA 的编码区也可以发生碱基的添加、删除或转变现象。这一现象首先在锥虫中发现,并称为 RNA 的编辑。锥虫线粒体 mRNA 的编辑是目前研究的较为深入的例子。     

mRNA研究的数据库资源

mRNA的功能除了指导蛋白质合成外,在其5′和3′端非翻译区包含的序列元件对基因表达和调控起着非常重要的作用,介绍了Transterm、UTR、ARED和TRSIG等研究mRNA结构和功能的数据库,并对其特点和使用作了介绍。     

反义RNA及其在植物基因工程领域的应用

随着反义RNA的发现及对其研究的深入,反义RNA技术已被广泛应用于基因调控的研究中。本介绍了反义RNA的概念,并就反义RNA的作用机理和在植物基因工程领域的应用进行了综述。其作用机理包括：在原核生物中反义RNA与引物RNA前体及mRNA分子5′的不同区域进行互补,从而抑制其复制、转录和翻译;在其核生物中反义RNA影响mRNA前体拼接、转移及mRNA分子5′和3′正常修饰。在植物基因工程领域,反义RNA主要应用于抑制果实成熟、抗病、作为反向筛选标记基因、控制花色、控制淀粉合成、控制油料种子中脂肪酸的合成、控制雄性不育等方面。     

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG),形成一个较长的与t-PA框架不同的阅读框     

HCV核心蛋白抑制干扰素α诱导的抗病毒基因表达及其机制研究

研究HCV核心蛋白对干扰素α诱导的抗病毒分子PKR和2′-5′OAS表达的影响及其机制。HCV核心蛋白表达质粒转染HepG2细胞,RT-PCR分析PKR和2′-5′OAS的mRNA水平变化,荧光素酶活性分析核心蛋白对ISRE介导的基因表达的影响;Western-blot分析SOCS3、STAT1及STAT1磷酸化水平的变化。在干扰素α刺激情况下,表达HCV核心蛋白的细胞中,PKR和2′-5′OAS的mRNA水平下降,ISRE介导的荧光素酶活性降低,STAT1磷酸化水平下降。此外,核心蛋白表达的细胞中SOCS3的mRNA和蛋白水平明显升高。结果表明,HCV核心蛋白可能通过激活SOCS3、抑制STAT1的磷酸化,从而下调干扰素α诱导的PKR和2′-5′OAS表达。     

一种新的cDNA 末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物,利用一种新的cDNA末端快速扩增方法(SMARTRACE)扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与mRNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA.结果表明,SMARTRACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术. Abstract:To clone the full-length cDNAs of genes related to spermatogenesis,ESTs obtained by mRNA differential display were used to design gene-specific primer.Then SMART RACE was performed to obtain the 5′ region of these ESTs.After cloning,sequencing and splicing with ESTs obtained by mRNA differential display,three full-length cDNAs were obtained.The results indicate that SMART RACE is a simple and an effective technique for cloning 5′-end unknown sequence of gene.     

HCV核心蛋白抑制干扰素α诱导的抗病毒基因表达及其机制研究

研究HCV核心蛋白对干扰素α诱导的抗病毒分子PKR和2′-5′OAS表达的影响及其机制。HCV核心蛋白表达质粒转染HepG2细胞,RT-PCR分析PKR和2′-5′OAS的mRNA水平变化,荧光素酶活性分析核心蛋白对ISRE介导的基因表达的影响;Western-blot分析SOCS3、STAT1及STAT1磷酸化水平的变化。在干扰素α刺激情况下,表达HCV核心蛋白的细胞中,PKR和2′-5′OAS的mRNA水平下降,ISRE介导的荧光素酶活性降低,STAT1磷酸化水平下降。此外,核心蛋白表达的细胞中SOCS3的mRNA和蛋白水平明显升高。结果表明,HCV核心蛋白可能通过激活SOCS3、抑制STAT1的磷酸化,从而下调干扰素α诱导的PKR和2′-5′OAS表达。     

真核mRNA 3′非翻译区的肿瘤抑制功能和表达调控

最近几年来,关于真核mRNA 3′UTR在肿瘤细胞恶性表型抑制中作用的研究, 取得了非常令人鼓舞的进展. 目前已经发现,3′UTR参与一些已知的癌基因和抗癌基因的功能调控; 一些抗癌基因的失活来源于其3′-UTR的结构变化;而且又发现了一些基因的3′UTR在转染恶性细胞后表现抗癌基因活性. 此外,3′UTR在mRNA表达调控中的作用也已研究得更加深入.现将最近几年来在这一领域的一部分研究进展情况,作一简单综述.     

真核mRNA3′非翻译区的肿瘤抑制功能和表达调控

最近几年来 ,关于真核mRNA 3′UTR在肿瘤细胞恶性表型抑制中作用的研究 ,取得了非常令人鼓舞的进展 .目前已经发现 ,3′UTR参与一些已知的癌基因和抗癌基因的功能调控 ;一些抗癌基因的失活来源于其 3′ UTR的结构变化 ;而且又发现了一些基因的 3′UTR在转染恶性细胞后表现抗癌基因活性 .此外 ,3′UTR在mRNA表达调控中的作用也已研究得更加深入 .现将最近几年来在这一领域的一部分研究进展情况 ,作一简单综述     

真核生物mRNA 3′非翻译区的功能

真核生物mRNA的3′非翻译区的功能复杂多样,不仅能调控其mRNA的稳定性、控制mRNA的亚细胞定位,而且还在特定氨基酸的编码过程中起着指导作用.一些真核生物mRNA的3′非翻译区内的突变可引起疾病的发生.近几年的研究又发现,一些真核生物mRNA的3′非翻译区还具有抑制肿瘤生长的功能.     

鸡PPARγ基因转录本3上游开放阅读框转录后的调控作用

过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是脂肪生成的关键调控因子。本实验室前期研究发现,与人和鼠等哺乳动物PPARγ基因的转录本不同,鸡PPARγ基因的多个转录本5′UTR区存在上游开放阅读框(upstream open reading frames, uORFs)。为了揭示该uORF转录后的调控作用,本研究构建了鸡PPARγ基因转录本3 (cPPARγ3)野生型5′UTR报告基因载体psiCHECK2-cPPARγ3- 5′UTR-WT和uORF突变(uATG突变为终止密码子TGA)的5′UTR报告基因载体psiCHECK2-cPPARγ3- 5′UTR-Mut。将这两个报告基因载体分别转染永生化鸡前脂肪细胞(immortalized chicken pre-adipocytes, ICPA)和鸡胚成纤维细胞DF1,检测海肾荧光素酶报告基因hRluc活性及其mRNA表达。荧光素酶报告基因检测结果显示,在ICPA细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut的hRluc报告基因活性极显著高于psiCHECK2- cPPARγ3-5′UTR-WT (P<0.01);在DF1细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut的hRluc报告基因活性高于psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-WT,但差异不显著(P>0.05)。qRT-PCR检测hRluc基因mRNA表达结果显示,与psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-WT相比,在ICPA细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞的hRluc基因的mRNA表达水平极显著降低(P<0.01);在DF1细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞后,hRluc基因的mRNA表达水平也降低,但差异不显著(P>0.05)。为进一步分析该uORF对鸡cPPARγ3的转录后调控作用,本研究又分别构建了野生型cPPARγ3真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ3-WT和uORF突变的cPPARγ3真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut。qRT-PCR检测cPPARγ3的mRNA表达水平,结果显示,在这两种细胞中,pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut转染细胞的cPPARγ3 mRNA表达水平均显著低于pcDNA3.1-cPPARγ3-WT转染细胞(P<0.05),但Western blot结果显示,pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut转染细胞的PPARγ蛋白表达水平极显著高于pcDNA3.1-cPPARγ3-WT转染细胞(P<0.01)。这些研究结果表明,5′UTR区的uORF抑制鸡cPPARγ3的翻译。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-7′在大鼠胚胎植入过程中的差异表达与调节

胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP-7)已经证实在人的妊娠过程中起了重要作用,但在大鼠中尚未见报道.在过去的研究中曾利用抑制消减杂交(SSH)方法分析了植入前和植入期的基因表达谱,发现IGFBP-7存在差异表达.通过RNA印迹和原位杂交,分析了IGFBP-7部分序列(编码区531～928nt,称作IGFBP-7′)在大鼠妊娠早期子宫中的时空表达模式.用RT-PCR方法检测了其在不同组织器官及假孕、人工诱导蜕膜化和延迟着床激活大鼠子宫中的表达模式.结果显示:在大鼠妊娠第5天IGFBP-7′mRNA的表达量开始增加,第5.5和6天表达量显著高于植入前期.IGFBP-7′mRNA主要表达于子宫腔上皮和腺上皮.IGFBP-7′mRNA表达无组织特异性,在大鼠的下丘脑、垂体、卵巢、子宫、心、肝、脾、肺、肾等器官均有表达,在假孕的D1～D6大鼠子宫中均有表达,但无显著性差异,诱导蜕膜化后IGFBP-7′mRNA的表达量也无明显变化,但在延迟着床激活的大鼠子宫中表达显著增加.这些结果提示,在植入期IGFBP-7′的表达增加主要是由胚泡引起的,而非蜕膜化.在大鼠妊娠早期,IGFBP-7′的表达增加可能有利于胚胎植入的发生.