人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原（preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZ:AF 325674;preS-LZ:325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物（preS－HZ）和兰州分离物（preS－LZ）全长522个核苷酸,编码174个氨基酸。preS－HZ与已发表的HBV adr亚型上海分离物、北京分离物、日本分离物、HBVadw亚型和ayw亚型preS基因的核苷酸序列同源性分别为96．7％、96．2％、97．3％、88．7％和84．1％,氨基酸序列同源性分别为96．0％、94．9％、97．1％、85．1％和85．4％;preS－LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96．4％、96．2％、96．9％、88．7％、83．7％,氨基酸序列同源性分别为94．9％、94．9％、96．0％、85．1％、84．1％,分子进化分析（ADNASTAR,1999）表明,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点,在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。     

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原(preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZAF325674;preS-LZAF325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物(preS-HZ)和兰州分离物(preS-LZ)全长522个核苷酸,编码174个氨基酸.preS-HZ与已发表的HBVadr亚型上海分离物[8]、北京分离物[9]、日本分离物[5]、HBVadw亚型[10]和ayw亚型[11]preS基因的核苷酸序列同源性分别为96.7%、96.2%、97.3%、88.7%和84.1%,氨基酸序列同源性分别为96.0%、94.9%、97.1%、85.1%和85.4%;preS-LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96.4%、96.2%、96.9%、88.7%、83.7%,氨基酸序列同源性分别为94.9%、94.9%、96.0%、85.1%、84.1%.分子进化分析(DNASTAR,1999)表明,克隆的两例HBVpreS基因属于adr亚型.preS-LZ与preS-HZ之间有两个核苷酸变异(对应两个氨基酸变异),相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点.在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗.     

人乙型肝炎病毒前表面抗原（preS）基因的突变及其在家蚕细胞中影响 …

为探讨人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前表面抗原（ｐｒｅＳ）基因的表达调控机理,以实现高效表达,利用ＰＣＲ方法在克隆的ｐｒｅＳ基因的第２、３位密码子引入同义突变。消除存在于５端编码区保守的反向重复序列,将ｐｒｅＳ基因及其突变形式（ＭｐｒｅＳ）分别重组到转移载体ｐＢＭ０３０,获得ｐＢＭ－ｐｒｅＳ和ｐＢＭ－ＭｐｒｅＳ。将ｐＢＭ－ｐｒｅＳ和ｐＢＭ－ＭｐｒｅＳ分别与野生型家蚕核型多角体病毒（ｂｍＮＰＶ）ＤＮＡ共转     

乙型肝炎病毒表面抗原在骨髓细胞中的存在及其与乙型肝炎病毒血清复制指标的关联

选择16例血清HBsAg阳性患者为实验组,19例血清HBsAg阴性患者为对照组,每一患者同时采取血清和骨髓涂片,用免疫细胞化学方法(PAP)检测骨髓涂片细胞中的HBsAg。结果,实验组3例骨髓细胞HBsAg阳性者,其血清中HBsAg滴度都很高,而且HBeAg均呈阳性。而在抗HBe阳性或HBeAg/HBeAb阴性者中均无骨髓细胞HBsAg阳性者。在5例血清HBV-DNA多聚酶阳性者中,骨髓细胞中HBsAg阳性者2例;6例多聚酶阴性者中,骨髓细胞中HBsAg阳性者仅1例。 本研究结果证明,HBV可在肝外组织细胞中测出,骨髓细胞HBsAg阳性的出现有集中于HBV高水平复制感染者中的倾向,同时更常见于HBV感染的较早时期。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr~-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。     

人乙型肝炎病毒(HBV)adr亚型基因组的多态性

由乙型肝炎adr亚型病毒(HBVadr)携带者26人的混合血清,得到了HBVadr基因组克隆株(PADR)158株,对这些克隆株进行四种限制性内切酶(BglⅡ,HindⅢ,PstⅠ,XhoⅠ)切点测定,并对其中S株的13种限制性内切酶图谱进行比较研究,发现同为adr亚型病毒,其基因组的限制性酶切图谱存在差异。另外,通过HindⅢ)切点得到的12个克隆株(PADR-H),也进行了酶切图谱分析。在这170个克隆株中,已经发现了5种类型的HBVadr基因组限制性酶切图谱,其中有6种酶(AvaⅠ,EglⅠ,BglⅡ,HincⅡ,HindⅢ,HpaⅠ)的7个变异点。本文报道了HBVadr基因组的多态性现象。     

人乙型肝炎病毒前表面抗原(preS)基因的突变及其在家蚕细胞中影响表达的研究

为探讨人乙型肝炎病毒 (HBV)前表面抗原 (preS)基因的表达调控机理 ,以实现高效表达 ,利用PCR方法在克隆的 preS基因的第 2、3位密码子引入同义突变 ,消除存在于 5 '端编码区保守的反向重复序列 ,将 preS基因及其突变形式 (MpreS)分别重组到转移载体 pBM0 30 ,获得 pBM preS和pBM MpreS。将 pBM preS和 pBM MpreS分别与野生型家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞 (BmN) ,经空斑筛选和杂交证实 ,分别获得重组病毒rBmNPV preS和rBmNPV MpreS。RNA点杂交和ELISA结果表明 :虽然在rBmNPV preS和rBmNPV MpreS感染的BmN细胞内都转录了 preS基因 ,但仅后者表达出 preS蛋白 ,提示preS基因的表达与基因内部起始区的反向重复序列密切相关。     

一种快速确定一个克隆DNA片段中的酵母核基因的方法

我们建立了一种用来确定在4-5kb那样大的DNA片段上携带一个克隆基因的界线的方法。这种方法由下列步骤组成。用四核苷酸识别序列核酸内功酶处理产生两组限制性消化产物以及起始于这种DNA片段的两个末端的任何一端都是用酵母转化来测定它们的互补能力。然后利用两个最短互补片段的重迭来确定这个基因。     

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了ｐＣＨＢＳＳＩＧ质料,其特点是ＣＭＶ立即早期启动子调控乙型肝炎（乙肝）表面抗原Ｓ＋前Ｓ１融合基因在前,ＳＶ４０早期启动子调控ＧＳ扩增基因在后,此质粒转化到ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中,经克隆加ＭＳＸ及ＭＴＸ筛选、扩增,建立了７个高效表达乙肝表达抗原Ｓ及前Ｓ１融合蛋白细胞系ＧｄＳＳ１,并检测了其中ＧｄＳＳ１－１８细胞系的生物学特性,结果表明：未发现微生物污染,无致瘤性、遗传稳定,电镜下可观察到２     

经典型霍乱弧菌毒素基因的核苷酸序列分析及其与ELTOR型的比较

本文首次报导了经典型霍乱弧菌569B株毒素基因的全部核苷酸序列,并与其他经典型和ELTOR型毒素基因的核苷酸序列以及由此推导的氨基酸序列进行比较。发现此两型毒素基因的A亚基核苷酸序列完全相同,而B亚基有2至3个碱基的差别,从而导致相应氨基酸的改变,它们分别位于第18、47和54位氨基酸残基。     

DNA序列分析与计算机的应用

研究核酸结构和功能相互关系的各种规律,这是科学工作者的基本目标。对分子生物学家来说,这意味着去弄清核酸序列中所包含的信息。这就是说要去分析和介绍这些序列的真正含义。由于大部分DNA分子实在太长,长期以来严重地妨害了我们对DNA分子进一步研究的种种努力。幸而,人们发现了限制性内切酶,这种酶可以把DNA大分     

大肠杆菌青霉素G酰化酶基因及其邻近区域的核苷酸全序列

我们由E.coli AS1.76克隆了青霉素G酰化酶的基因,并且测定了其全部核苷酸序列。青霉素G酰化酶结构基因是由下述功能片段组成的:(1)编码信号肽(26个氨基酸残基)的78个碱基对;(2)编码α-亚基(209个氨基酸残基)的627个碱基对;(3)编码间隔肽(54个氨基酸残基)的162个碱基对;(4)编码β亚基(557个氨基酸残基)的1671个碱基对。此外,我们还发现起始密码子(ATG)前有个核糖体结合位点和启动子序列以及在终止密码子(TAA)之后有个转录终止信号。与最近发表的青霉素G酰化酶基因的DNA序列比较,同源性达99.7%。     

黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析

以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过RT-PCR扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析.所克隆的PEP基因全长为1 581bp,编码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基.与GeneBank中已报道的A.niger CBS513.88的PEP序列同源性最高,达到99.75%.脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高.     

猪细小病毒NS1基因的克隆与序列分析

目的:扩增猪细小病毒(Porcine Parvovinls,PPV)LJL12株NS1基因的全长序列,并进行同源性分析.方法:参考GenBank上公布的PPV中国株NS1基因序列,设计一对特异性引物增LJL12株NS1基因,测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析.结果:LJL12 株 NS1 基因伍长 1989bp,编码 662个氨基酸.与其他 PPV 中国株 NS1 的核苷酸同源性在 98.6%～100%之间,氨基酸同源性在98.5%～100%之间.其中,与南京株的同源性最高.结论:PPV NS1 蛋白具有高度保守性,适合用作诊断抗原.LJL12 株PPV NS1 基因的克隆,为进一步研究 NS1 的功能和作用奠定了基础.     

pGEM-8Hepc克隆载体的构建与序列分析

hepcidin是一种由肝脏合成的富含半胱氨酸的小分子肽,它的主要生物学功能是维持机体铁稳态,并且具有抗菌活性.本实验从大鼠肝脏组织克隆出hepcidin基因,用同尾酶法构建多拷贝串联基因克隆载体pGEM-nHepc(n=1,2,4,8)(单个hepcidin基因之间用一段连接肽的DNA连接),分别含有不同拷贝首尾串连的hepcidin cDNA,并在大肠杆菌DH5 α中扩增.重组体经双酶切和PCR鉴定后进行序列测定,所得结果与genbank中的大鼠序列比对,结果完全正确,为后续进一步的表达纯化奠定了基础.     

人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析

Laryngeal carcinoma related gene 1(LCRC1)是一个喉癌候选抑瘤基因,为进一步深入研究其转录调控机制,应用5'RACE技术确定了该基因的转录起始位点,然后在对人LCRG1基因进行生物信息学分析的基础上,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了11种含不同长度LCRG1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,-169～ 127区域的启动子活性最高.研究提示,LCRG1基因转录所必需的基因启动子序列在-169～ 127范围内.     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.