一种适合PCR反应的产黄青霉基因组简易提取方法

为同时高效地对大量产黄青霉(Penicillium chrysogenum)突变株进行分子鉴定,本实验探索了一种适合PCR反应的简易产黄青霉基因组提取方法。该方法首先将产黄青霉菌丝转移至0.7 mol/L Na Cl为等渗剂的蜗牛酶(6 mg/m L)和纤维素酶(4 000 U/m L)酶解液中,超声波处理10 min,然后于28℃酶解14 h,最后95℃加热处理10 min。结果表明,应用该方法获得的裂解液上清稀释后可直接作为PCR反应模板,且扩增条带清晰。该方法操作简便,用样量小,可在96孔板一个孔中完成DNA模版的制备过程,并且可同时并行多个样品,适于大规模产黄青霉基因工程突变株的检测,并为其它真菌基因组的提取提供了参考。     

一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法

以CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-冻融裂解法直接抽提土壤总微生物的基因组DNA,利用G8000沉淀和纯化DNA.结果表明,该方法是一种简便、有效可直接应用于PCR分析的土壤总微生物基因组DNA的抽提方法.采用含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的缓冲液预洗,添加CaCl₂和BSA,可以去除腐殖酸;用PEG8000沉淀DNA,可以提高DNA质量;采用冻融法破碎细胞,CTAB、溶菌酶和蛋白质酶K共同作用以裂解细胞,可以保证获得大片段的DNA,提高DNA产率.用该方法抽提的七子花林下土壤总微生物DNA产率为9.22 μg·g^-1,A260/A280为1.65,可适用于 PCR扩增及扩增rDNA限制酶切分析(ARDRA)技术,适宜的模板DNA浓度为0.67 ng·μl^-1.快速、有效、可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA提取方法的建立,为大规模的土壤微生物分子生态学研究提供了可能.     

临床标本细菌基因组DNA提取方法探讨

目的优化细菌基因组DNA提取方法,使其适合临床细菌分子生物学检测需要。方法分别采用专用DNA提取液法、热裂解法、溶菌酶法、热裂解法与碱性裂解法组合改良法,对纯培养细菌和临床标本中细菌基因组DNA进行提取。结果专用DNA提取液法、溶菌酶法提取成功率为100%,热裂解法革兰阳性菌提取成功率为0%,革兰阴性菌成功率为100%,碱性裂解液法在NaOH浓度大于4 mmol时提取成功,临床标本在NaOH溶液超过20 mmol/L并含2%SDS时细菌基因组DNA的提取成功率为100%。结论热裂解法与碱性裂解法组合改良法提取细菌基因组DNA方便快速、简单实用,适用临床标本检测。     

去壁酶与酶解方式对曲霉原生质体释放的影响

研究了纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶以及菌丝体培养方式和酶解方式对黑曲霉和米曲霉菌丝释放原生质体的效应。发现黑曲霉菌丝原生质体制备最佳条件为固体透析培养菌丝体,2%纤维素酶,在平皿中,28℃和80r/min条件下酶解3h;米曲霉原生质体制备最佳条件为2%纤维素酶+1%蜗牛酶+5mmol/L二硫苏糖醇,酶解时间6h,其它条件与黑曲霉的相同。     

高质量毕赤酵母基因组DNA提取方法比较

旨在比较5种毕赤酵母基因组DNA的提取法,以便获得简便高效的提取高质量酵母基因组DNA的优化方法。分别使用蜗牛酶破壁法,超声波破碎法,液氮研磨法,Lyticase破壁法,试剂盒法提取毕赤酵母基因组DNA,然后进行DNA电泳检测以及紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。结果显示,5种方法均能提取出酵母基因组DNA,而酶法所提取的酵母基因组DNA质量最好。由此证实,蜗牛酶法成本低、效果好,是理想的提取高质量酵母基因组DNA的方法,完全满足后续试验要求。     

苛求芽孢杆菌基因组DNA提取方法的比较

目的:比较不同方法提取苛求芽孢杆菌基因组DNA的差异。方法:用经典CTAB提取法、改进CTAB法(溶菌酶处理结合CTAB提取法)、UniQ柱吸附提取法制备苛求芽孢杆菌基因组DNA,比较产物完整性和用于PCR扩增的有效性。结果:三种方法制备基因组DNA纯度接近,但改进CTAB法产率最高,UniQ法产率最低。经典CTAB法和UniQ法提取基因组DNA易降解。三种方法所得基因组DNA用于PCR扩增效率接近。结论:溶菌酶裂解结合CTAB提取更适合制备苛求芽孢杆菌基因组DNA。     

基于PCR DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立

通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR—DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法。采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNAV3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析。SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌。改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR—DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障。     

沼气池污泥微生物总DNA提取方法的比较

沼气发酵系统是一个复杂的生态系统,其污泥微生物超过99%是不可培养的。为了优化沼气池纤维素的转化效率、沼气的产率和开展污泥微生物多样性研究,本研究采用化学裂解法、溶菌酶裂解法和QIAampDNA Stool Mini Kit提取了沼气池污泥样品中微生物的总DNA,对三种方法的DNA得率、纯度、大片段提取效果以及是否含有PCR反应抑制剂进行了研究,最后对16S rRNA基因V3区的扩增产物进行了PCR变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析。与化学裂解法和QIAamp DNA Stool Mini Kit法相比,溶菌酶裂解法得到的DNA量大、片段长、片段分布广、PCR扩增效率高;同时PCR-DGGE图谱显示,溶菌酶裂解法可更好地展示沼气池污泥中微生物的多样性。该结果为进一步提高沼气池中纤维素的转化效率和沼气生产优势菌种的质和量打下了一定的前期基础。     

一种简单、快速的苏云金芽胞杆菌基因组DNA提取方法

从培养时间、裂解溶液、抽提和沉淀时间等方面对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因组DNA提取技术进行改进.提取8株对蛴螬有杀虫活性的野生Bt菌株的基因组DNA,分析其纯度,并进行PCR分析与酶切分析.试验结果表明,新的提取方法耗时36 min,明显短于旧方法所用时间(97 min);两种方法提取的基因组DNA A260/A280均大于1.8,无明显区别;琼脂糖凝胶电泳结果显示,上样量相同时,新方法提取的基因组DNA浓度是旧方法的5倍以上;新方法提取的基因组DNA能作为模板灵敏地扩增出测试基因,所提取的DNA能被限制性内切酶完全酶切,证明DNA具有很高的纯度.本研究改进的基因组DNA提取方法耗时短、产量高,并能满足PCR扩增、酶切等分子生物学需要.     

康氏木霉B—7和黑曲霉X—15原生质体的形成和再生

研究了康氏木霉B－7和黑曲霉X－152株纤维素酶高产菌株的原生质体制备与再生。结果表明,采用纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶的混合酶液,可成功地制备2株真菌的原生质体。其中,B－7以这3种酶的配比6：5：2为最佳,X－15以8：4：2为最佳。原生质体形成的缓冲液系统均以0．2mol/L,pH6．0磷酸盐缓冲液为宜,渗透压稳定剂则分别以0．6mol/LNaCl和0．6mol/L蔗糖为宜。以菌龄18h（B-7）和16h（X－15）2株真菌的菌丝体,在37℃下酶解90min可获得最适量的原生质体,产量分别达9×106个／ml和1．9×107个／ml,且其再生率也较高,均达95％左右。