杂色鲍齿舌的显微与亚显微结构

为研究鲍的消化生理学、鲍的齿舌形态构造与鲍健康状况之间的关系,我们采用石蜡切片、Harris苏木素-伊红染色,光学显微技术及扫描和透射电镜技术,较全面地观察研究了杂色鲍的物理消化器官-齿舌的显微与亚显微结构。结果表明：“大龄幼鲍”和“成鲍”的齿舌齿式为：∞+5+1+5+∞,即齿舌由1列中央齿,每边5列侧齿和不定数的缘齿构成。随着鲍龄的增加,齿舌的长带状的基本形态保持不变,但长度和宽度都有所增加,长度的增加是由其齿舌横排数目的增加,舌齿大小的扩大及邻近横排舌齿的间距的增加造成;齿舌宽度的增加是由其舌齿宽度的扩宽,第3到第5侧齿的定期增加,缘齿数目的稳定线性增加造成。     

杂色鲍鳃的显微与亚显微结构

本文采用光镜和电镜方法,研究了杂色鲍（Haliotis diversicolor）鳃的显微和亚显微结构。结果表明,杂色鲍的鳃为一对不等大的双栉状鳃,各鳃由鳃轴和两侧列生的状鳃叶组成,鳃叶上皮为单层上皮组织结构,细胞类型主要为：纤毛细胞、立方细胞、腺细胞;鳃轴上皮为鳃叶上皮的延伸,亦是单层上皮组织,细胞类型主要有：纤毛细胞、微绒毛立方细胞和腺细胞等;鳃叶远轴端游离缘表皮之下,含有几丁质杆支撑的血腔,血腔内可见血细胞及未分化的间充质细胞,血腔之间有平滑肌纤维束和疏松结缔组织,疏松结缔组织内含胶原纤维、纤维细胞、成纤维细胞、脂肪细胞及未分化的间充质细胞等;鳃轴的皮下组织也含有几丁质杆、平滑肌纤维、疏松结缔组织及其间的血腔结构。     

杂色鲍的胚胎发育

杂色鲍（Ｈaliotis diversicolor Reeve）的胚胎发育分为个阶段共３２个发育期,其中,卵裂阶段有１３个时期：受精期、第１极体放出期、第２极体放出期、２细胞分裂早期、２细胞期、４细胞期、８细胞期、１６细胞期、３２细胞期、６４细胞期、１２８细胞期、桑椹期和囊胚期。胚胎发育阶段有４个时期：原肠期、担轮幼体早期、担轮幼体晚期和担轮幼体孵化瞬期、胚后发育阶段有１３个时期：担轮幼体期、面盘幼虫早期、面盘幼体中期、面盘幼体后期、匍匐幼体中期、铺匐幼体后期、围口壳幼体早期、围口壳幼体中期、围口壳幼体后期、上足分化幼体早期、上足分化幼体中期和上足分化幼体后期。幼鲍阶段有２个时期：第１呼吸孔出现早期,和１呼吸孔出现,须适宜水温范围内,随着水温升高,孵化期相应缩短,在水温１８－３４℃条件下,受精卵不同程度都能孵化,但孵化率和孵化时间则有很大差别。在水温18℃时,鲍卵从受精至开始孵化需经历11hr32min,孵化率占2.5‰,平均孵化期为26hr15min,孵化速率为0.0381,周限增长率为1.0010/hr;而在水温22℃条件下,经过7hr30min才开始孵化,平均孵化期为23hr5min,孵化速率为0.0415,周限增长率为1.0202/hr。鲍卵受精后,在水温为23.7-28.5℃、盐度为32.8‰-34.5‰（比重10223-1.0229）的条件下,只需经23－24d能发育为幼鲍（为第一个呼吸孔出现期）。     

杂色鲍头触角的显微与亚显微结构

本文采用光镜和电镜方法,研究了杂色鲍(Haliotisdiversicolor)头触角的显微和亚显微结构。结果表明,杂色鲍头触角的表皮布满乳头状突起,突起表面布满微绒毛,顶端具纤毛。头触角作为重要的感觉器官之一,具触觉兼嗅觉功能,其上皮为特殊的感觉上皮,其组成细胞主要包括三种类型:支持细胞、感觉细胞、腺细胞。头触角表皮之下的成分为平滑肌纤维和疏松结缔组织,疏松结缔组织里含胶原纤维、成纤维细胞、肥大细胞、微孔细胞、变形细胞等成分。     

杂色鲍足的显微与超微结构

杂色鲍（Haliotis diversicolor）隶属软体动物门、腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目、鲍科、鲍属。鲍的足是柔韧性很好的器官,它具有运动、支持、感觉与辅助捕获功能,是鲍生活中匍匐和吸附岩石等固着物的重要部位,因其首先接触环境而成为脓疱病、裂壳病、弧菌病等病病原体的主要侵袭部位,这些病可造成十分严重的鲍死亡现象。国内学者对鲍足的研究文献较少,仅有关于皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）足的组织学（崔龙波等,1997）及皱纹盘鲍足的粘液细胞的片断研究（王宜艳等,2004）报道。     

三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰腺均一化cDNA文库的构建

用RDP试剂提取三丁基锡暴露诱导的杂色鲍肝胰腺总RNA,经Oligotex纯化得到 mRNA;应用SMART技术合成双链cDNA,双链特异核酸酶(DSN)进行双链cDNA的均一化,构建了杂色鲍三丁基锡暴露诱导下的均一化cDNA文库.原始文库的库容为4.3× 106 CFU/ml,重组率为 97.9%.从文库中随机挑选了3 288个克隆进行测序,得到3 048个高质量EST序列,其中有 370条 Contigs,2 103条 Singlets,Unigenes共 2 473条,冗余率为18.86%.以上结果说明该文库质量较好,为进一步筛选相关功能基因打下基础;较低的冗余率说明该文库值得继续使用大规模ESTs测序的方法寻找相关功能基因,并为进一步使用基因芯片技术研究相关功能基因的表达谱提供便利.     

细菌攻毒杂色鲍血淋巴细胞抑制性差减杂交文库构建及巨噬细胞表达蛋白cDNA的克隆与差异表达

以雌性杂色鲍为对象, 以大肠杆菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的混悬液做为攻毒菌, 利用抑制性差减杂交(SSH)技术构建细菌攻毒的杂色鲍血淋巴细胞SSH cDNA文库。随机挑取生长菌落110个克隆子, 进行菌液PCR鉴定, 计算文库重组率为98.18%, 文库容量为1.37×106 pfu。将重组子测序, 经BLAST一致性搜索比对分析, 有一重组片段含有穿孔素(Perforin)保守结构域, 为巨噬细胞表达蛋白(MEP)类穿孔素部分cDNA序列, 片段大小为1 551 bp, 连续编码517个氨基酸残基, 申请GenBank登录号为EU272049。经半定量PCR和荧光定量PCR差异显示分析, 发现在细菌感染状态下MEP基因在血淋巴细胞中存在明显的上调表达现象。     

杂色曲霉素的分离、纯化及鉴定

将两株杂色曲霉菌分别接种于4kg玉米豆粉固体产毒培养基,28℃静置培养35d。以甲醇-4％ KC1(9:1)混合液及甲醇-三氯甲烷混合液浸提杂色曲霉素(sterigmatocy stin,简称ST),再用三氯甲烷萃取,经硅胶柱层析法初步纯化。在甲醇、乙腈、乙醚、丙酮等溶剂中多次重结晶,最后得到2271.6mg淡黄色针状结晶。经过熔点测定、元素分析、四种光谱学鉴定、薄层层析及高效液相色谱鉴定,确认该晶体为ST。纯度在99.9％以上。     

杂色曲霉素的分离,纯化及鉴定

将两株杂色曲霉菌分别接种于4kg玉米豆粉固体产毒培养基,28℃静置培养35d。以甲醇-4％ KC1(9:1)混合液及甲醇-三氯甲烷混合液浸提杂色曲霉素(sterigmatocy stin,简称ST),再用三氯甲烷萃取,经硅胶柱层析法初步纯化。在甲醇、乙腈、乙醚、丙酮等溶剂中多次重结晶,最后得到2271.6mg淡黄色针状结晶。经过熔点测定、元素分析、四种光谱学鉴定、薄层层析及高效液相色谱鉴定,确认该晶体为ST。纯度在99.9％以上。     

养殖大菱鲆溃疡症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

2004年夏季山东海阳一带养殖大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)暴发溃疡病。症状主要表现为体表病灶部位出血、肌肉溃烂、眼球凸出等,解剖可见鳃丝贫血,肝脏充血,肾脏和胆囊肿大,肠壁充血并呈透明状,从出现发病症状起,大约一周后开始出现死亡。从病鱼体表溃疡部位及内脏分离出优势菌并命名为H1,经人工感染证实H1即为引起本次养殖大菱鲆体表溃疡症的病原菌。对病原菌进行鉴定揭示该菌革兰氏染色阴性,菌体呈短杆状,极生单鞭毛。综合该菌在形态、生理生化、API20NE与API20E自动鉴定结果、16S rDNA同源性等方面的特性,确认H1为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),该菌对呋喃妥因、菌必治等多种抗生素敏感。哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌,但作为养殖大菱鲆的病原菌属首次报道。     

九孔鲍四倍体诱导的研究

采用二倍体鲍卵子,抑制其第一极体、抑制其第一极体和第二极体诱导四倍体,用三倍体鲍卵子与普通鲍精子受精并抑制其第一极体,以及用三倍体鲍的其它方法诱导四倍体。用倍体分析仪检测DNA相对含量以判别其倍性。实验结果,先后共培育出存活的四倍体鲍239个,个体大小为2.5～6.0cm;挑选性腺发育较好的四倍体鲍(包括雌雄),与普通鲍杂交繁育三倍体,先后共培育出10批次,培育出的苗量共计15.8万个。     

Development of 11 polymorphic microsatellite loci in the small abalone (Haliotis diversicolor Reeve)

Eleven polymorphic microsatellite loci for Haliotis diversicolor were isolated and characterized from (CT)(n) - and (AC)(n) -enriched library. They were tested in 24 individuals from a natural population. All of them were polymorphic, with the number of alleles varying between three and 10. The observed heterozygosities and expected heterozygosities ranged from 0.083 to 0.913 and from 0.159 to 0.856, respectively. The 11 isolated microsatellite loci, except SA-JMU6 and SA-JMU12, followed Hardy-Weinberg expectations. Seven sets of primers also amplify in closely related species, H. ovina and H. asinine. These 11 polymorphic microsatellites will be useful for analysing the population structure and genetic diversity in H. diversicolor.     

南方九孔鲍鲍苗掉板病原菌的药敏测定

为提高鲍鱼培苗的成活率,对分离自广东汕尾一养殖场鲍苗掉板池中(包括水、藻膜和变白鲍苗)的、经回归感染试验证明为致病菌的菌株进行了鉴定和药物敏感性测定。API鉴定表明,这些致病菌株由Vibrio alginolyticus,Vibrio cholerae,Vibrio parahaemolyticus等组成,其中弧菌17株,约占总分离菌株的50％,而溶藻弧菌则为弧菌的优势菌株,有11株,约占弧菌总数的70％。药敏结果显示,绝大多数菌株对链霉素、红霉素和庆大霉素敏感;相反,四环素和新生霉素则对它们没有作用或不敏感。     

九孔鲍卵子发生及卵巢发育的组织学观察

采用组织学方法研究了九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)的卵子发生、卵巢结构及其发育.根据卵细胞的大小、形状,核仁的形态,卵黄颗粒的积累情况,滤泡的结构等.将九孔鲍卵子的发生分为卵原细胞、卵黄发生前的卵母细胞和卵黄发生期的卵母细胞3个时期;卵巢壁由外膜及内生殖上皮构成,生殖上皮分化产生卵原细胞和滤泡细胞;卵巢的结构单位是滤泡.根据卵巢的外部形态和内部组织结构,将九孔鲍的卵巢发育分为休止期、增殖期、生长期、成熟期和排放期共5期.     

Genetic changes in muscle protein following hybridization between Haliotis diversicolor reeve Japan and Taiwan populations revealed using a proteomic approach

Protein expression patterns were compared in a Japan and Taiwan population of Haliotis diversicolor and in a hybrid between them using 2DE and MALDI‐TOF‐TOF analyses. Using the software PDQuest, 924 ± 7 protein spots were detected in the Japan population (RR), 861 ± 11 in the Taiwan population (TT), and 882 ± 9 in the F₁ hybrid (TR). RR and TR were clustered together, but the distance between RR and TT was the maximum using hierarchical cluster analysis. A total of 46 gel spots were identified and a total of 15 spots matched with abalone proteins (a 33.6% identification rate). Hybrid exhibiting additivity or overdominance accounted for 73.9% of these 46 identified proteins. The 46 differentially expressed proteins were shown to be involved in major biological processes, including muscle contraction and regulation, energy metabolism, and stress response. The proteins involved in energy metabolism included adenosine triphosphate (ATP) synthase β subunit, fructose 1, 6‐bisphosphate aldolase, triosephosphate isomerase, enolase, arginine kinase, and tauropine dehydrogenase. These proteins exhibited additivity in their offspring. The proteins involved in stress responses included HSP Hsp70 (exhibiting overdominance in the offspring) and Cu/Zn‐superoxide dismutase (exhibiting additivity). These results suggested that proteomic approach is suitable for analysis of heterosis and functional prediction of abalone hybridization.     

九孔鲍养殖水体及其肠道不同菌群抗药性研究*

为更好地防治鲍鱼病害的发生和流行,对分离自广东汕尾健生鲍鱼养殖场九孔鲍养殖环境及其肠道中不同细菌菌群的耐药性进行了研究。结果表明,四环素、青霉素G、卡那霉素、丁胺卡那霉素和新生霉素均对绝大多数异养菌和弧菌菌株都不敏感或无作用;相反,氟哌酸、红霉素、氯霉素以及环丙沙星等则均对它们比较敏感;复方新诺明、链霉素和多粘霉素B对弧菌菌株均有作用,而且多粘霉素B也对水体中的异养菌群相当有效。