短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

CX3CL1 RNA干扰慢病毒载体的构建包装与鉴定

摘要 目的：构建包装趋化因子CX3C的配体1（CX3CL1）RNA干扰慢病毒载体。方法：参考目的基因CX3CL1序列,设计PCR引物扩增相应的干扰序列,然后将干扰序列连接至pLVX-shRNA2酶切后的线性化载体上,通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆,即为构建成功的pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒干扰载体。将构建好的慢病毒干扰载体同慢病毒包装载体共同转染293T细胞,收集上清,纯化浓缩后即为pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒。最后将慢病毒感染BMSCs细胞,QPCR检测慢病毒的干扰效率。结果：经过酶切能切出大小约为6500bp和1350bp的两条带,获得与预期结果相一致的DNA片段,并通过测序验证了序列的准确性,成功构建CX3CL1 RNA慢病毒干扰载体。然后经过包装、纯化浓缩后得到pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒。QPCR结果表明干扰组明显抑制了CX3CL1mRNA的表达,干扰效率在70%以上。结论：成功构建包装CX3CL1干扰慢病毒载体,并证实其显著沉默了BMSCs细胞CX3CL1的表达,为CX3CL1在BMSCs移植的大鼠缺血性脑卒中炎症反应的机制研究奠定基础。     

基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

目的 构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法 以烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，缺失TRV RNA2的2b基因5"端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒（pea early-browning virus，PEBV）外壳蛋白（coat protein，cp）基因启动子，获得pTRV2e²载体；在pTRV2e²载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因，测定病毒TRVe²表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果 病毒TRVe²能快速同时表达2个非融合的外源蛋白，且至少能表达70 ku外源蛋白，且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中；病毒TRVe²可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论 本文构建的重组病毒TRVe²为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。     

慢病毒介导N2ICD过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株的构建及鉴定

[目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定后,三质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,收集且浓缩病毒毒液用于感染人胃癌MKN45细胞并筛选稳定细胞株,用Western Blot验证。[结果]成功构建慢病毒重组质粒N2ICD/pLV;包装病毒后,荧光显微镜下观察到大部分HEK293T细胞发出绿色荧光;收集病毒毒液感染MKN45细胞,显微镜下观察有部分细胞表达绿色荧光蛋白;流式分选技术筛选得到稳定细胞株,Western Blot鉴定结果显示:相比于空白对照组,稳定株的N2ICD过表达明显。[结论]成功构建慢病毒表达质粒N2ICD/pLV,并建立稳定过表达N2ICD的胃癌细胞株N2ICD/pLV-MKN45。     

慢病毒载体介导的层黏连蛋白受体稳定抑制细胞株的建立

目的:构建靶向层黏连蛋白受体(LR)基因的小发卡RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,鉴定其对LR的抑制效果,并筛选LR稳定抑制的He La细胞株。方法:设计针对LR的sh RNA序列,将此序列和H1启动子克隆入含有EGFP报告基因的p Lenti6/v5慢病毒表达载体,通过病毒包装、细胞感染、抗生素筛选获得稳定细胞株,用real-time PCR和Western印迹检测筛选得到的稳定细胞株中LR的表达水平。结果和结论:构建了含有LR靶向sh RNA的慢病毒表达载体,包装成病毒后感染He La细胞,经抗生素筛选后获得了稳定抑制LR的细胞株;筛选后的细胞均可观察到报告基因EGFP的表达;经m RNA和蛋白水平检测,LR-sh6和LR-sh7均可显著抑制He La细胞株中LR的表达。     

胶质瘤来源外泌体通过高迁移率族蛋白B1促进胶质瘤干细胞形成

摘要 目的：研究胶质瘤来源外泌体中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对胶质瘤干细胞形成的影响及其意义。方法：使用外泌体提取试剂盒提取原代胶质母细胞瘤来源外泌体,通过透射电子显微镜、纳米粒度电位仪和Western blotting对外泌体进行鉴定;采用Western blotting检测外泌体中HMGB1的表达量;通过qRT-PCR、Western blotting、克隆球计数检测外泌体对胶质瘤干细胞形成的影响;siRNA敲低HMGB1的表达水平,并通过qRT-PCR、Western blotting、克隆球计数检测外泌体中HMGB1对胶质瘤干细胞形成的影响。结果：原代胶质瘤细胞可以分泌外泌体到肿瘤微环境并且外泌体中存在HMGB1;原代胶质瘤细胞来源外泌体可以上调邻近胶质瘤细胞干性相关分子CD133、OCT4、NANOG、SOX2的表达并促进干细胞克隆球的形成;通过siRNA敲低原代胶质瘤细胞HMGB1的表达后,外泌体中HMGB1的含量降低并且外泌体促进胶质瘤干细胞形成的作用减弱。结论：胶质瘤细胞来源外泌体可以通过HMGB1促进胶质瘤干细胞的形成。     

原子力显微镜下淋巴瘤患者血浆外泌体的物理特征

目的 外泌体是细胞外囊泡的一种，被认为是一种生物信息载体。本文探究在AFM检测下淋巴瘤患者血浆中外泌体的物理特性。方法 从不同亚型淋巴瘤患者的外周血中提取外泌体，首先利用静电吸附法将分离的外泌体固定在云母基质上，然后应用原子力显微镜（AFM）扫描获取外泌体的多参数图像。在纳米/微尺度上，取得外泌体的形貌与力学信息并统计比较。结果 利用AFM表征单个外泌体的力学信息。其中，表面黏附力图像显示，外泌体边缘的能量耗散高于中心部分，因此具有显著边缘效应，来自不同亚型淋巴瘤患者的血浆中外泌体杨氏模量存在差异。结论 血浆中外泌体可被提取并在经过处理固定后可被AFM捕获并测量，血浆外泌体有望成为肿瘤诊断及治疗的新型生物标志物，外泌体的物理特性可能与其生物学性能存在关联。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA,sgRNA),基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力...     

间充质干细胞来源外泌体对脑内小胶质细胞极化和炎症因子释放的影响及机制研究

摘要 目的：探究间充质干细胞外泌体对脑内小胶质细胞极化和炎症因子释放的影响及其机制。方法：收集体外培养的间充质干细胞上清，超高速冷冻离心获取外泌体。采用纳米颗粒系统和透射电子显微镜分别检测外泌体粒径大小、形态结构和功能完整性。通过免疫荧光、ELISA和细胞流式等方式检测LPS刺激下，外泌体对BV2细胞的表型极化和炎症因子释放的影响。采用Western Blot法检测间充质干细胞外泌体对BV2细胞JAK1/STAT3通路活化的影响。结果：（1）间充质干细胞分泌的外泌体粒径大小主要介于40-100 nm，透射电镜显示外泌体形态呈典型膜性"杯盘"状结构；（2）流式结果表明，相比于对照组，LPS组能显著激活M1型小胶质细胞表面标志物CD11b和M2型小胶质细胞表面标志物CD206的表达，而经外泌体处理，CD11b的表达显著被抑制，CD206显著升高。同时ELISA结果证实，相比于LPS组，外泌体组分泌的促炎症因子（IL-1β、IL-6）和NO水平显著降低（P<0.05），抗炎因子（IL-10）显著升高 (P<0.05)；（3）间充质干细胞外泌体显著提高了BV2细胞JAK1/STAT3通路的磷酸化水平。结论：间充质干细胞外泌体通过激活JAK1/STAT3通路有效促进脑内小胶质细胞M1型向M2型极化。     

间充质干细胞外泌体中的RNA与蛋白质

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)外泌体是MSC中的多泡小体与细胞膜融合时分泌到细胞外环境中的50～200 nm大小的细胞外囊泡。MSC外泌体含有TSG101、CD9和CD81等典型蛋白质与多种RNA。人们逐渐认识到外泌体是通过传递其蛋白质和RNA等内容物到受体细胞发挥作用的。因此,MSC外泌体的治疗潜能可能是因为它含有特殊的蛋白质或RNA。该文对外泌体蛋白质和RNA的作用机制进行探究,并提出MSC外泌体很可能通过蛋白质而不是RNA发挥效应。     

Sprouty-2对胃癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的影响

目的:研究Sprouty2(SPRY2)基因在胃癌肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭转移的影响。方法:体外培养人胃癌细胞(BGC-823),采用慢病毒介导的sh RNA沉默SPRY2基因,并用实时定量PCR与Western blot检测其SPRY2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达,采用细胞划痕实验、Transwell实验检测SPRY2基因沉默后的胃癌细胞侵袭转移能力变化。结果:在慢病毒介导sh RNA沉默SPRY2基因的人胃癌BGC-823细胞中,SPRY2的m RNA和蛋白表达明显降低(P0.05),SPRY2沉默后人胃癌细胞E-cadherin的蛋白表达增多(P0.05),vimentin的蛋白表达减少(P0.05)。此外,SPRY2沉默后,胃癌细胞迁移能力和侵袭能力明显减弱(P值均P0.05)。结论:Sprouty-2基因通过调节E-cadherin与vimentin的表达参与胃癌细胞的上皮-间质转化,进而促进胃癌细胞的迁移与侵袭。     

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A 细胞Tmub1 基因沉默及稳定感染细胞 系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。     

慢病毒介导的稳定表达LBH的前列腺癌细胞株的建立

目的:构建稳定表达LBH基因的人前列腺癌细胞株PC-3M-LBH,探讨LBH基因对PC-3M细胞增殖能力的影响。方法:构建表达LBH基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒,感染低表达LBH基因的人前列腺癌PC-3M细胞后,经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法(Western-Blot)分别检测细胞株中LBH的mRNA、蛋白表达水平;采用CCK-8法检测表达LBH基因后细胞增殖能力的改变。结果:成功构建了重组慢病毒表达质粒p Lenti-LBH并包装出了慢病毒,感染前列腺癌细胞后经嘌呤霉素筛选得到PC-3M-LBH细胞株;PC-3M-LBH细胞株中LBH基因的mRNA和蛋白表达显著上调;相对母细胞和NC对照组,PC-3M-LBH细胞在接种后第4天即出现明显的生长抑制,到第6天其生长抑制率达到19.7%。结论:构建的细胞株能稳定表达LBH基因,该基因的表达能显著抑制前列腺癌PC-3M细胞的体外增殖。     

基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统建立与应用

目的:构建能够用于稳定动态监测细胞自噬流变化和过表达基因的红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-鼠源LC3融合慢病毒多功能表达载体(PCDH-Duo-mRFP-eGFP_(ph)-LC3_(rat),PCDH-Duo),并构建小鼠腹腔巨噬细胞Raw264. 7稳转株观察自噬流变化。方法:应用基于PCR精确合成mRFP-eGFP_(ph)-LC3_(rat)融合全基因,将其克隆至慢病毒表达载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP中,重组质粒经菌落PCR、酶切及测序分析正确无误后,包装慢病毒,转染Raw264. 7细胞,并利用流式分选术获取稳转株,经氯喹抑制自噬模型及Western blot鉴定eGFP蛋白表达确认其可靠性。结果:成功构建了PCDH-Duo重组慢病毒质粒,包被慢病毒并获得Raw264. 7稳定细胞系(Raw264. 7-PCDHDuo),可稳定表达双荧光蛋白,经3mmol/L氯喹作用6h后,能够稳定准确指示自噬流变化。结论:成功构建了基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统,为研究细胞自噬与编码基因及非编码基因之间的关系提供了方便有力的工具。     

miR-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的作用及机制研究

目的:探讨mi R-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:首先构建慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,然后感染椎间盘退变髓核细胞得到稳定过表达细胞系,同时设置空载体和空白细胞组对照。用荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白GFP的表达,分别提取三组细胞总RNA,采用RT-q PCR方法检测mi R-155的表达;通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western-Blot检测细胞中凋亡相关蛋白FADD、Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况。结果:在荧光显微镜下,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白细胞组未见绿色荧光;RT-qPCR结果显示构建的稳定过表达细胞系(GV369-miR-155-NP)中mi R-155的表达水平较高,且与空载体细胞系及空白细胞对照组均呈显著性差异(P0.05);与空载体组(GV369-NP)及空白细胞对照组相比,过表达组(GV369-miR-155-NP)细胞凋亡率显著降低(P0.05),FADD、Caspase-3、Bax的表达水平均明显下降,而Bcl-2表达水平显著增加(P0.05)。结论:mi R-155可能通过靶向结合Caspase-3和FADD阻止FasL-Fas途径或通过线粒体途径抑制人椎间盘退变髓核细胞凋亡。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

过表达miR-153非小细胞肺癌细胞稳转株的构建及鉴定

目的:构建过表达miR-153的非小细胞肺癌的稳转细胞株,为进一步探讨miR-153在肺癌发生发展中的作用奠定基础。方法:构建具有嘌呤霉素抗性的miR-153慢病毒载体;体外培养非小细胞肺癌细胞系SPC-A-1和A549,加入浓度梯度的嘌呤霉素溶液,筛选出最佳浓度;使用慢病毒转染细胞株,并在转染72 h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,评价转染效率;体外实验使用PCR检测miR-153在稳转株的表达;稳转株移植裸鼠体内成瘤,取出瘤体后检测瘤体内EGFP和miR-153的表达。结果:完成过表达miR-153慢病毒载体及阴性对照载体的构建;确定嘌呤霉素最佳筛选浓度:在SPC-A-1细胞中的浓度为2.0 g/mL,A549细胞中的浓度为3.0 g/mL;目的基因miR-153被慢病毒成功导入SPC-A-1细胞和A549细胞中,荧光显微镜下能直接观察到EGFP。转染miR-153组和阴性对照组的PCR实验结果显示:在SPC-A-1细胞中,miR-153的表达量为92.9±20.6,明显高于阴性对照组(P=0.016);在A549细胞中,miR-153的表达量为2624.6±153.4,显著高于阴性对照组(P0.001)。稳转株能在裸鼠体内形成移植瘤,瘤体内明显有EGFP的表达;与阴性对照组的瘤体相比,移植瘤组miR-153的表达量为显著上调(P=0.048)。结论:成功构建过表达miR-153的非小细胞肺癌的稳转细胞株。     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

利用逆转录病毒载体建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系

目的:建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法:利用包装细胞获得重组的逆转录病毒,感染人类胚胎干细胞,为干扰组ShSMAD2、载体组VECTOR和野生型组WT;经荧光筛选获得阳性克隆;Realtime-PCR检测SMAD2 mRNA的表达。结果:带GFP荧光标记的SMAD2特异性shRNA逆转录病毒感染人类胚胎干细胞后,获得稳定干扰SMAD2表达的人胚胎干细胞系。经检测shSMAD2组SMAD2 mRNA表达较VECTOR和WT组明显降低,VECTOR和WT组之间无明显差异。结论:通过SMAD2特异性shRNA逆转录病毒载体构建了稳定干扰SMAD2的人类胚胎干细胞。