Streptomyces aidingensis CGMCC 4.5739中环二肽氧化酶DmtD3_E3的体外生化功能

【背景】环二肽合酶(cyclodipeptide synthase, CDPS)途径中新颖后修饰酶的挖掘对获得结构新颖活性良好的二酮哌嗪类化合物具有重要意义。前期研究中发现来源于Streptomyces aidingensis CGMCC 4.5739的环二肽合酶基因簇dmt3中dmtA3B3C3可编码二酮哌嗪—萜类化合物drimentines (DMTs),推测其下游环二肽氧化酶基因dmtD3_E3也参与了DMTs的生物合成,但其功能一直未鉴定。【目的】对S.aidingensisCGMCC 4.5739中环二肽合酶基因簇dmt3内的环二肽氧化酶DmtD3_E3的功能进行表征,为增加二酮哌嗪类化合物结构多样性提供功能元件。【方法】从S.aidingensisCGMCC 4.5739的基因组中克隆环二肽氧化酶基因dmtD3_E3,构建重组表达质粒pWLI209,并在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶性表达。通过建立体外酶促反应,运用液质联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等方法确定催化产物结构。【结果】环二肽氧化酶DmtD3_E3可催化环二肽cyclo-(L-Trp-L-Leu) (cWL)的C14-C17位氧化脱氢形成cyclo-(L-Trp-L-ΔLeu) (cWΔL)。此外DmtD3_E3还可以催化环二肽cyclo-(L-Trp-L-Ala) (cWA)的C10-C11位脱氢生成cyclo-(L-Trp-L-ΔAla) (cΔWA),具有底物宽泛性。【结论】本研究通过对环二肽合酶生物合成途径中新颖环二肽氧化酶的挖掘和表征,为后续通过组合生物合成及合成生物学手段生成“非天然”二酮哌嗪类化合物衍生物奠定了基础。     

短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶脱氢催化机理

【目的】为研究短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶(sNPEO-DH)的脱氢氧化机制(基因克隆于Ensifer sp.AS08),我们进行了以下实验。【方法】采用同源序列比对及同源建模的方法筛选出与其辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)异咯嗪基邻近的4个氨基酸残基。以定点突变方法分别构建了突变体,并进行了重组蛋白的表达纯化和酶活力测定。【结果】野生型和突变体的酶学动力学实验表明,突变体N90A和N509A对亲水性底物聚乙二醇(PEG1000)的相对活性分别降低为51%和89%,对疏水性底物sNPEO的活性分别降低为26%和40%,说明氨基酸残基N90和N509可能与底物的结合相关。突变体H465A的相对活性丧失了90%以上,突变体N507A完全丧失活性;瞬时"停-流"检测实验进一步证明N507A突变体阻断了底物向FAD传递质子的过程,突变体H465A阻断了对FAD还原形成的FADH2脱氢再生的过程。【结论】以上结果说明N507和H465为sNPEO脱氢酶活性中心中参与对底物氧化脱氢及FADH2脱氢再生进行下一次反应的催化位点。     

酮基合酶AlpRQ影响醌那霉素的产量

【背景】角蒽环类聚酮化合物醌那霉素生物合成基因簇包含了两套酮基合酶(KSα和KSβ)的编码基因,即alpA,alp B和alpR,alpQ,AlpA和AlpB被证明是醌那霉素合成过程中必需的酮基合酶,而AlpR和AlpQ则被认为与别的化合物的合成相关。【目的】鉴于alpR和alpQ和必需基因alpS在醌那霉素合成基因簇上紧密相邻,本研究旨在确定它们与醌那霉素生物合成的相关性。【方法】PCR-targeting在细菌人工染色体(BAC)文库质粒上进行多基因敲除,构建好的文库质粒再导入通用宿主Streptomyces albus J1074中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测突变株和野生型菌株的发酵产物。【结果】AlpR和AlpQ对醌那霉素的合成没有直接影响,但是敲除AlpRQ突变株的发酵液中醌那霉素的产量显著提高了。【结论】AlpR和AlpQ很有可能是另一Ⅱ型聚酮化合物的KS_α和KS_β,它们与AlpA和AlpB竞争共同的合成前体。本研究还证明了AlpR和AlpQ并不能替代AlpA和AlpB的功能。     

吸水链霉菌井冈变种的色素合成基因缺失对井冈霉素产量的影响北大核心CSCD

【目的】通过缺失井冈霉素高产菌株TL01中4个典型的色素合成基因簇来考察其对井冈霉素产量、菌体生长和发酵液颜色的影响。【方法】通过同源重组双交换对4个色素合成基因簇进行逐个同框缺失,HPLC检测突变株井冈霉素产量的变化,q RT-PCR检测突变株中井冈霉素合成基因转录变化,通过称量菌丝体干重来绘制其生长曲线。【结果】和出发菌株TL01相比,多巴类黑色素基因簇缺失株PY06中井冈霉素的发酵产量由原来的20.6 g/L上升至23.1 g/L,提高了12%;III型聚酮合酶编码的黑色素基因簇缺失株PY07产量无明显变化;II型聚酮合酶编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因簇缺失分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有缺失突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。【结论】不同色素基因的缺失对井冈霉素产量和菌株生物量积累具有不同的影响。多巴类黑色素与井冈霉素的生物合成过程竞争共同前体,将其中断后使前体流向井冈霉素生物合成,达到了进一步提高产量的目的。     

教酒链霉菌NRRL 3882中钙霉素生物合成后修饰基因calD的功能分析

【目的】钙霉素是二价阳离子载体,是一类含有吡咯环的聚醚类抗生素,广泛用于细胞二价阳离子的生物学功能研究。本文以钙霉素生物合成基因簇中cal D基因为研究对象,通过蛋白质同源序列比对、基因敲除、回补验证及HPLC/MS分析,对cal D基因的功能进行表征。【方法】对cal D基因功能进行生物信息学预测。选用钙霉素产生菌Streptomyces chartreusis NRRL 3882,通过PCR-targeting的方法对cal D基因进行敲除获得突变株,再将cal D基因克隆到链霉菌整合质粒上,通过接合转移技术将cal D回补到缺失株中。使用HPLC/MS技术对菌株发酵产物进行分析。【结果】生物信息学预测Cal D蛋白酶属于氧化还原酶。获得cal D基因敲除突变株Δcal D及基因回补菌株Δcal D:cal D。HPLC/MS检测到cal D基因的缺失菌株大幅降低钙霉素产生能力,与野生型菌株相比,突变株中积累更多的3-Hydroxylcezomycin和更少的氮-去甲基钙霉素。【结论】cal D参与钙霉素的生物合成。cal D的缺失导致3-Hydroxylcezomycin的积累,推测cal D负责钙霉素生物合成途径中苯并噁唑环3位上羟基转化成酮基的氧化反应。初步阐明了cal D基因在钙霉素生物合成途径中的功能机制。     

斑鸠霉素氧化酶CftA体外生物活性研究

【背景】斑鸠霉素及其氧化衍生物属于多环特特拉姆酸大环内酰胺类化合物,具有良好的生物活性,挖掘更多新颖斑鸠霉素类似物具有重要意义。细胞色素P450氧化酶CftA被认为能催化斑鸠霉素的氧化反应,但未有相关体外实验数据的报道。【目的】通过体外生化实验鉴定氧化酶CftA的功能,并探索其催化斑鸠霉素氧化反应的机制。【方法】利用基因合成的方法直接克隆斑鸠霉素氧化酶基因cftA,于大肠杆菌中诱导表达后,纯化蛋白进行体外酶反应,利用高效液相色谱与高分辨质谱联用技术鉴定酶反应产物。【结果】在体外,氧化酶CftA催化斑鸠霉素生成一个新的氧化衍生物Hydroxyikarugamycin D和一个已知氧化衍生物Clifednamide A。【结论】进行了细胞色素P450氧化酶CftA的体外生化研究,证实其能特异性催化斑鸠霉素C29位的两步氧化反应,为进一步探索斑鸠霉素P450氧化酶的催化机制,以及通过生物酶催化拓展斑鸠霉素类多环特特拉姆酸大环内酰胺化合物的结构多样性奠定了基础。     

醌那霉素生物合成中间产物的一锅酶促体系研究

【目的】 通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】 纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一锅酶法进行体外反应,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测反应产物;利用该体系探究Ⅱ型硫酯酶AlpS在合成通路中的功能及作用底物;利用单一变量法对体系温度、pH、最小聚酮合酶(minimal polyketide synthase, minimal PKS)浓度和Ⅱ型硫酯酶AlpS浓度等条件进行优化。【结果】 体系所需的聚酮合酶和辅助蛋白均获得可溶性表达;利用一锅酶法成功合成了醌那霉素的早期重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin;加入AlpS蛋白后以上5种产物产量均有不同程度的提高,其中prejadomycin和dehydrorabelomycin提高较为显著;优化后的反应最适条件为:温度30℃、pH 7.0、最小聚酮合酶(AlpA、AlpB和RavC)浓度各2.8 μmol/L、AlpS 7.2 μmol/L;prejadomycin的产量提高到302 mg/L。【结论】 本研究成功利用一锅酶法在无细胞条件下重构了醌那霉素的早期生物合成途径,合成了醌那霉素的重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin。研究进一步验证了硫酯酶AlpS的链释放功能并推测其作用底物。     

一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法

【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段,通过分析突变菌株积累的中间产物,可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上,对每个基因进行同框缺失耗时耗力,因此,优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法,实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记,同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法,在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比,构建同框缺失载体的效率明显提高;Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。     

吸水链霉菌HS023 milF基因敲除构建产5-酮米尔贝霉素基因工程菌

【目的】通过敲除吸水链霉菌HS023的mil F基因,构建产5-酮米尔贝霉素的基因工程菌。【方法】构建mil F基因敲除质粒p MSST-Δmil F,转入米尔贝霉素产生菌——吸水链霉菌HS023,获得mil F基因敲除的双交换突变株F2-18。【结果】发酵结果表明:mil F基因敲除突变株F2-18不再产生米尔贝霉素,仅产生中间产物5-酮米尔贝霉素,且发酵单位较出发菌株略有提升。【结论】通过敲除mil F基因,发酵可生产5-酮米尔贝霉素,并直接用于驱虫药米尔贝肟和乐平霉素的化学合成,可大大简化从米尔贝霉素到米尔贝肟和乐平霉素的合成步骤。     

萘醌-氧吲哚生物碱coprisidins生物合成途径的研究

[目的] 新颖结构的天然萘醌-氧吲哚类生物碱coprisidins（A和B）分离自昆虫肠道相关链霉菌,具有预防癌症的活性。作为首例具有萘醌-氧吲哚骨架的生物碱,对其独特生物合成机理的研究可为II型聚酮类化合物生物合成途径提供新的认知。[方法] 本研究对coprisidins的产生菌Streptomyces sp.SNU607进行全基因组测序,并根据测序结果的生物信息学分析初步定位coprisidins的生物合成基因簇;通过基因敲除以及异源表达手段确定coprisidins的生物合成基因簇;基于体内遗传学实验与生物信息学分析初步推导coprisidins的生物合成途径。[结果] Streptomyces sp.SNU607中有23个基因簇可能参与次级代谢,其中4个基因簇与聚酮合酶（PKS）相关;通过基因敲除与异源表达实验,本研究证实1个II型PKS负责coprisidins的生物合成;基于生物信息学分析,我们推测copH/I/M/O/N构成了1个基因盒,并负责起始单元丁酰CoA的合成;KS_β（CopB）的序列比对表明coprisidins的II型PKS系统更倾向于合成C20的初始聚酮链。[结论] Coprisidins的萘醌-吲哚结构是由II型PKSs催化形成,我们推测丁酰CoA是coprisidins聚酮骨架的起始单元,在最小PKS、聚酮酶、环化酶的催化下先形成类似蒽环的四环系统,随后在后修饰酶与氧化重排的作用下生成萘醌-氧吲哚骨架。本研究为进一步探究萘醌-氧吲哚类生物碱的生物合成机制奠定了基础,同时增加了II型PKSs合成产物的结构多样性。     

哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶的体外功能

【目的】系统鉴定哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶(Acyl-ACP synthetase,Aas S)以不同链长游离脂肪酸和非脂肪链羧酸作为底物的体外催化反应。【方法】利用非变性蛋白质凝胶电泳和紫外分光光度计法从定性和定量两个方面分析了Aas S的体外催化功能与活性。【结果】Aas S能够催化不同链长直链的自由脂肪酸合成脂酰-ACP,其中以C6–C12作为底物时活性最高;以羟基脂肪酸作为底物的情况下,Aas S催化C8–C14的羟基脂肪酸有较高的活性。非脂肪链羧酸类作为底物的反应中,20种蛋白质氨基酸、苯甲酸和水杨酸均可以作为Aas S的底物,合成相应的脂酰-ACP。【结论】本研究系统地证明了哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶(Aas S)对不同底物的不同催化活性,为生物体内氨基酸代谢和菌黄素合成代谢的研究提供了可行性的分析依据。     

bagZH编码酪氨酸酶样铜酶并参与bagremycin生物合成

【目的】研究bagremycin产生菌链霉菌Tü4128中编码酪氨酸酶样铜酶的bagZH基因的功能。【方法】基于同源重组技术敲除bagZH基因,利用HPLC和LC-ESI-MS分析其次级代谢产物谱。在E. coli BL21(DE3)中异源表达BagH并分离纯化,分别以邻氨基酚和3,4-AHBA为底物,利用LC-ESI-MS分析BagH催化产物。【结果】HPLC显示,bagZH基因敲除突变株的bagremycin产量显著降低,回补bagZH基因表达盒后bagremycin产量有所上调。LC-ESI-MS分析bagZH基因敲除突变株的次级代谢产物谱,结果显示,保留时间为3.18 min的新产物分子量为286.32 g/mol,与推测的3,4-AHBA在体内酯化合成的产物分子量吻合。体外生化分析显示,BagH能将邻氨基酚的邻位氨基氧化为亚硝基(保护基团)。【结论】本文首次鉴定了bagZH基因编码的酪氨酸酶样铜酶参与bagremycin生物合成。BagH负责将3,4-AHBA的邻位氨基氧化为亚硝基(保护基团)避免自身酯化,待与反式对香豆酸衍生物缩合后,再由胞内的还原酶将保护性亚硝基还原为氨基,最终合成bagremycin A和bagremycin B。我们的研究结果为bagremycin作用机制的深入研究以及高产菌株的理性设计与改造提供了基础和参考。     

黄芩苷对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响及体内外的抑菌作用

[目的]探讨中药单体黄芩苷对嗜水气单胞菌在体内外生长及生物膜形成的影响.[方法]体外实验中,利用牛津杯法检测抑菌圈直径,结晶紫法检测生物膜的形成,通过泳动实验检测黄芩苷对嗜水气单胞菌运动性的影响,紫外吸收法检测细胞膜完整性,用透射电镜技术观察黄芩苷对细菌形态的影响.体内实验利用草鱼为对象检测黄芩苷对嗜水气单胞菌增殖的影...     

苏云金芽胞杆菌Sigma54和CcpA共同调控的基因鉴定

【目的】通过综合分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD73菌株Sigma54缺失突变体的转录组数据和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579菌株CcpA缺失突变体的转录组数据,并进行启动子与CcpA蛋白的体外结合验证,明确Bt HD73菌株中Sigma54和CcpA共同调控的基因,丰富了对微生物的代谢调控网络的认识。【方法】以转录组测序结果为基础,通过基因同源性的比对在Bt HD73菌株中寻找受Sigma54和CcpA共同调控的基因,在这些基因中找到具有cre序列的启动子,通过凝胶阻滞验证这些启动子与CcpA蛋白的结合。【结果】Bt HD73菌株中有31个基因受Sigma54和CcpA共同调控,其中14个基因的启动子序列包含cre序列,这些启动子都可以与CcpA蛋白发生体外结合。【结论】Bt HD73菌株中有14个基因直接受CcpA的调控,同时其转录受Sigma54的控制。     

嗜水气单胞菌zntR调控的生理功能及其机制研究

【目的】ZntR是一种金属调控蛋白,可催化锌外排基因的转录激活,防止细胞内二价Zn离子过量,但其对细菌生理功能的影响目前尚不清楚。【方法】本研究构建了嗜水气单胞菌ATCC7966(Aeromonas hydrophila,A.h)的zntR缺失株及补救株,对菌株的生物被膜形成能力、溶血活性、运动能力和响应金属离子胁迫等生理表型进行评估。【结果】敲除zntR基因的菌株对锌和铬离子胁迫敏感、对钴离子胁迫耐受,并且生物被膜形成能力下降、运动能力增强,这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。进一步利用DIA定量蛋白质组学技术比较野生株和zntR缺失株的蛋白表达差异,发现ZntR还可能参与双组分系统、细菌的趋化性等代谢通路的调控。【结论】该研究结果可为今后深入探讨zntR转录因子参与细菌生理功能的调控机制提供理论依据。     

荧光假单胞菌ZX对采后锦橙绿霉病的防治及其抑菌机制

【目的】采后柑橘极易受指状青霉(Penicillium digitatum)侵染而发生严重的绿霉病腐烂,生物防治因具有安全、有效、环保等特点近年来备受关注。论文旨在研究荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZX对采后柑橘绿霉病的防治效果,揭示P.fluorescensZX对P.digitatum可能存在的作用机制。【方法】以"北碚447"锦橙果实为试材,先分别接种20μL拮抗菌培养液、滤液(培养液离心后,上清经0.22μm滤膜过滤)、菌悬液(培养液离心后,菌体用无菌水反复洗涤并用无菌水重悬)和热杀死液(培养液高温高压灭菌),2 h后接种20μL P. digitatum孢子悬浮液(1×10~4spores/m L),所有果实于20oC、90%相对湿度环境下恒温恒湿培养8 d后,测定果实的发病率和病斑直径;制备柑橘皮培养基,进行平板抑菌试验,探索P. fluorescens ZX对P. digitatum孢子发芽情况的影响;采用两板对扣法和生物熏蒸法研究P.fluorescensZX挥发性次级代谢产物的抑菌作用;利用插入式细胞培养皿等分析P.fluorescensZX和P.digitatum之间竞争的营养物质;同时,测定P.fluorescensZX的生长曲线,利用结晶紫染色法评估P. fluorescens ZX的生物膜形成能力。【结果】P. fluorescens ZX不同处理液之间对采后锦橙绿霉病的作用效果差异显著,菌悬液抑菌效果最好,经菌悬液处理的果实,发病率和病斑直径分别仅为40.83%和1.78 cm;不论是在柑橘皮固体培养基上对峙培养还是在液体培养基中混合培养,菌悬液和原液的作用效果较好,固体平板上,相对抑制率达到了35%–45%,液体培养基中,P. digitatum孢子12 h后的发芽率不超过27%;P. fluorescens ZX产生的挥发性物质具有抑菌作用,经P. fluorescensZX熏蒸处理的锦橙果实,发病率和病斑直径都显著降低;营养竞争试验结果表明,P. fluorescens ZX能更快速有效地消耗柑橘皮培养基中的营养,并和P. digitatum竞争葡萄糖、果糖、蔗糖、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、精氨酸和脯氨酸等营养物质;同时,P. fluorescens ZX生命力强,培养4 h后即进入对数生长期,约24 h后形成成熟的生物膜。【结论】P. fluorescens ZX可能通过抑制P. digitatum孢子发芽、营养与空间竞争、形成生物膜、产生抑菌物质等方式抑制P.digitatum的生长繁殖,有效防治采后锦橙绿霉病。     

双组分系统rcsC基因影响禽致病性大肠杆菌的致病性及相关生物学特性

【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。     

卡氏德巴利酵母植酸酶在毕赤酵母中的异源表达及优化

【背景】植酸是一种能螯合金属离子和蛋白质的有机磷类化合物,广泛存在于植物组织中,影响动物对营养元素的吸收。在饲料中加入植酸酶可有效降解植酸。【目的】构建毕赤酵母异源表达卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castellii,D. castellii)植酸酶的菌株,促进卡氏德巴利酵母植酸酶的研究及工业应用。【方法】将卡氏德巴利酵母植酸酶基因进行密码子优化后转入毕赤酵母GS115中,通过筛选多拷贝、敲除蛋白酶、过表达分子伴侣及转运蛋白的方法获取优势菌株。【结果】所得重组菌株GS115/DCphy(ΔPep4)(BFR2)的产酶酶活是低拷贝菌株的7倍。【结论】研究结果为卡氏德巴利酵母植酸酶的异源表达及潜在工业应用提供了一定的指导。     

KL2型鲍曼不动杆菌噬菌体解聚酶克隆及抗菌活性分析

【背景】噬菌体解聚酶是噬菌体在裂解细菌过程中产生的一种抗菌蛋白,关于鲍曼不动杆菌荚膜分型及常见型别噬菌体解聚酶的研究报道较少。【目的】以KL2型鲍曼不动杆菌为研究对象,从噬菌体IME-AB2中克隆解聚酶,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外抗菌活性。【方法】应用二代测序及生物信息学方法鉴定鲍曼不动杆菌荚膜型,分析IME-AB2全基因组。应用分子克隆技术克隆ORF76假定的尾丝蛋白(Putative Tail Fiber)基因,构建重组表达载体pEASY-Blunt-E1-gp76,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化解聚酶,研究解聚酶体外抗菌活性。【结果】构建了pEASY-Blunt-E1-gp76解聚酶重组表达质粒,该重组质粒在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白在体外能够对所有的KL2型鲍曼不动杆菌具有较好的抗菌活性,解聚酶联合人和狗的血清具有很好的杀菌活性。【结论】鉴定解聚酶并提高其抗菌谱具有重要意义,也是噬菌体及解聚酶用于治疗耐药菌研究领域急需解决的重要问题之一。