鱼源溶藻弧菌生物学特性和病理组织学观察

【目的】溃烂病是我国海水养殖及南方养殖斜带石斑鱼的常见严重病害之一。通过对患病的斜带石斑鱼病原菌的分离与鉴定,为检测其耐药性和控制石斑鱼在海水养殖中溃烂病的爆发和流行奠定基础。本文目的是研究斜带石斑鱼相关的病原菌的特性。【方法】从患病斜带石斑鱼肾脏、肝脏病灶组织,分离纯化得到病原菌,进行纯化培养、人工感染和回归感染、ATB细菌自动鉴定及药敏试验,并进行菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定。【结果】确定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。两株典型菌株经人工感染和回归感染均显示自然发病症状。药敏试验表明,该菌具有较强的耐药性,在所检测的抗菌药物中,对青霉素等3类抗菌药物高度耐药,而对氯霉素等5类抗菌药物敏感。器官主要组织病理学变化为:肝细胞、肾小管细胞等变性、坏死,病变组织有炎性细胞浸润且呈变质性炎症。溶藻弧菌对机体的主要器官造成严重病理损伤。【结论】生理生化等结果均证实分离菌株是溶藻弧菌,而且产生多重耐药情况较为普遍,未来应加强对养殖海水中病原耐药性和斜带石斑鱼病原感染的监测。     

网箱暂养石斑鱼体表微生物的研究

石斑鱼(Epinephelus)是福建沿海地区重要的经济鱼类之一,主要用于出口。出口之前需在网箱中暂养一段时间。在网箱暂养阶段,石斑鱼易患烂皮病,尤其是在4～6月份。病鱼的主要病症为烂鳍、脱鳞、皮肤红肿、溃烂直至死亡。迄今尚未看到有关石斑鱼体表正常菌群及烂皮病防治的研究报道。因此,在石斑鱼发病季节,我们进行了网箱暂     

我国鱼类寄生原生动物的研究进展

我国水产养殖事业具有悠久的历史,而且远在11—12世纪的宋代就有鱼病方面的零星记载。但直到解放前夕,鱼病学研究还是一个空白。解放后,随着水产养殖业迅速发展,广大群众对严重影响养殖产量的鱼病,迫切地盼望有关部门进行研究和提出有效的控制措施。我国的鱼病学研究,就是为配合水产养殖事业的迫切需要,从无到有、从小到大地建立和发展起来的。在鱼病学的研究过程中,鱼类寄生原生动物的研究起着先鞭的作用。       

点带石斑鱼的亲鱼培育、产卵受精和胚胎发育

在水泥池人工养殖条件下,对人工诱导性逆转的“功能性雄性”、天然雄性及天然雌性点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)亲鱼进行强化培育,自然产卵受精。2002年繁殖季节,共获3cm以上的点带石斑鱼苗145万尾。亲鱼培育、产卵受精和胚胎发育的程序：(1)经过强化培育的亲鱼,自然产卵受精,受精率平均81％,最高97％;(2)成熟的“人工变性雄鱼”的精子头部呈球型,精子头径约3．7—6．1gm,尾长12．4～44．5μm;在水温26℃、盐度3％、pH7．9条件下,精子游动时间最长超过58min,精液中90％精子在31min停止游动,与天然雄亲鱼的精子无异,可作为生产雄亲鱼的来源;(3)在东山岛,产卵期由4月初持续到11月中旬,产卵高潮集中在4月底至5月底、9月底至10月初。在24h内,自然产卵通常从16：30持续到次日1：30;(4)产卵适宜水温为23．5—28．6℃,最适产卵水温为25．5—26．5℃;(5)水温26℃时,受精卵在盐度2．82％～2．96％,的海水中呈悬浮状态,盐度2．82％以下时下沉,盐度2．96％以上时上浮;(6)在水温24．9—27．6℃、盐度3％—3．3％、pH7．6—8．2的情况下,胚胎发育时间为21h。     

鞍带石斑鱼精子诱导斜带石斑鱼雌核生殖

石斑鱼性成熟时间长和雌雄同体的特性延长了其育种的周期, 采用人工雌核生殖策略能够显著提高选育效率。研究筛选了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)精子人工诱导斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)雌核生殖的最佳条件, 并通过形态学、流式细胞术和微卫星分子标记等方法进行鉴定。结果显示, 灭活的异源精子可成功诱导斜带石斑鱼人工雌核生殖, 精子灭活的最佳紫外照射强度为518 mJ/cm2; 卵子受精后6min在4—6℃的条件下进行冷休克处理, 可获得最优的40%的表观受精率(卵子正常分裂比率)和29.7%的孵化率, 而未冷休克的对照组具有83.5%的表观受精率和80%的单倍体率。多重比较结果表明, 在表观受精率方面人工诱导的时间差异(P=0.579)和水温差异(P=0.133)并不显著; 而在孵化率上, 处理时间组间差异极显著(P=0.002), 而在水温组中差异不显著(P=0.396)。胚胎发育结果显示, 人工雌核生殖诱导会导致孵化率降低, 单倍体胚胎出现明显的发育障碍。微卫星分子标记鉴定结果显示, 石斑鱼人工雌核生殖子代的遗传物质大部分来自于母本, 同时也存在异精效应。     

青石斑鱼海水循环水养殖水体的细菌群落特征北大核心CSCD

【目的】为揭示工厂化循环水青石斑鱼养殖水体的细菌群落特征,比较患病养殖池与健康养殖池的细菌群落结构差异,探讨细菌群落结构与青石斑鱼病害相关的相关性。【方法】采用Illumina Miseq高通量测序方法,分析比较了患病和健康养殖水体细菌群落结构、α-多样性指数(包括多度、均一度和系统发育多样性);并结合传统方法从患病青石斑鱼病灶部位分离疑似病原菌。【结果】患病和健康养殖水体中细菌群落的α-多样性并无太大差异,但主坐标分析与热图样本聚类分析表明细菌群落结构明显不同。二者的优势细菌门均为Proteobacteria、Verrucomicrobia和Bacteroidetes,但它们的相对丰度差异显著。患病养殖水体中α-Proteobacteria(25.07%)和γ-Protebacteria(22.74%)丰度相当,而健康养殖水体中γ-Protebacteria(40.49%)显著高于α-Proteobacteria(10.87%)。患病水体的Verrucomicrobia丰度(26.4%)远高于健康水体(10.9%);而Bacteroidetes的相对丰度则相反(12.3%vs 20.9%)。主要的差异类群包括α-Proteobacteria的Rhodobacteraceae和Rhodospirillaceae,γ-Proteobacteria的Alteromonadaceae、HTCC2188和Oceanospirillaceae,Verrucomicrobia的Verrucomicrobiaceae和Bacteroidetes的Cryomorphaceae。更表现在核心微生物类群的差异,健康养殖池水体以Glaciecola、HTCC、Sediminicola、Prevotella等对于养殖动物有益或无害的属为核心微生物;而患病养殖池水体则以Vibrio、Rubritalea、Oleibacter等病原菌或对养殖动物不利的属为核心微生物。从患病青石斑鱼的皮肤、肝脏和脾脏共分离得到弧菌20株,Acinetobacter haemolyticus 1株。【结论】患病的青石斑鱼循环水养殖水体中的细菌群落明显不同于健康养殖水体,特别是核心微生物的差异,其以Vibrio等病原菌或对养殖动物不利的属为主。该结果为青石斑鱼循环水养殖系统的管理、病害的诊断和监测提供理论与实验基础。     

斜带石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)受精细胞学的组织切片观察

人工诱导雌核发育二倍化的关键是掌握极体排出和卵裂的时机,掌握该规律最直接的方式即进行受精细胞学的研究。以鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)为父本,斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)为母本,通过人工授精获得受精卵,收集受精后不同时刻的卵子,经Smith′s液固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色和显微组织观察。结果表明:受精后第30~60 s精子入卵;第3 min精子星光出现;第5 min卵子排出第二极体;第7~15 min雌雄原核相互靠近,并最终融合;第15 min以后合子核开始分裂。鞍带石斑鱼精子进入斜带石斑鱼卵子的时间与多数硬骨鱼类比较没有显著差别;但是,第二极体排出及第一次卵裂的时间较早。研究展示了斜带石斑鱼与鞍带石斑鱼杂交的受精细胞学的基本发育过程,并为后续的人工诱导石斑鱼雌核发育研究提供了理论依据。     

斜带石斑鱼仔鱼变态过程中甲状腺的发育变化

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)属鲈形目,科,石斑鱼属,为暖水性中下层鱼类,是我国南方沿海重要的经济养殖鱼类。长期以来,许多海水鱼仔稚鱼培育阶段的一大难题是成活率低1。目前斜带石斑鱼的大规模苗种培育仍未很好解决,仔鱼经历第二背鳍棘从生长到吸收的变态过程时死亡率很高。       

龟鱼混养水质变化对鱼病影响研究

通过对龟鱼混养水体水质与养鱼水体水质进行监测,观察龟鱼混养对水质的影响。实验结果表明龟鱼混养可调节水体酸碱度,增加水体透明度,提高水体溶解氧,降低水体有机物污染,净化水质,改善水体生态环境,同时还能在一定程度上抑制总大肠菌群。龟鱼混养改善了水质,有利于减少鱼病的发生,对减轻鱼病防治中化学性药物对水体环境的危害、建立生态养殖之路、降低养殖成本和推进集约化养殖具有重要的现实意义。     

斜带石斑鱼阿片黑素促皮质素原全长cDNA克隆及序列分析

通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA库和随机测序,克隆了其阿片黑素促皮质素原(Proopiomelanocortin,POMC)全长cDNA。斜带石斑鱼POMC全长cDNA为863bp(含Poly(A)),编码的POMC多肽前体为219aa。氨基酸序列比较分析表明：斜带石斑鱼POMC前体包含有促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropin,ACTH),α—促黑素(α—melanocyte stim—datinghormone,α—MSH),β—促黑素(β—MSH),γ—促脂素(γ-lipotrophic hormone,γ-LPH),β—内啡肽(β-endorphin)等,但缺失了γ—促黑素(γ-MSH)和大部分连接区。斜带石斑鱼POMC与哺乳动物POMC的同源性为39％—42％左右,与鸟类的同源性为42％左右,与两栖类的同源性为36％—41％,与其他鱼类POMC的同源性为38％—77％。斜带石斑鱼和罗非鱼的POMC的ACTH功能区都为40个氨基酸残基,而其他脊椎动物为39个氨基酸残基。     

白鹇的人工养殖研究

白鹇是我国南方山区有人工养殖前景的羽肉型经济野禽。本文总结了８年多养殖结果,证实白鹇能在人工条件下顺利生长、繁殖。种群产卵期延长至３个半月,个体平均产卵达到１９．５枚,卵的量衡度明显增加,受精率达到９１．４％,孵化率达到８７．３％,１月龄雏成活率达到９３．７％。本文还提供了规范化养殖技术。     

9种石斑鱼遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析

利用实验室克隆的13个青石斑鱼微卫星分子标记, 对中国南海海域9种石斑鱼(青石斑鱼、蜂巢石斑鱼、鲑点石斑鱼、黑边石斑鱼、鞍带石斑鱼、赤点石斑鱼、七带石斑鱼、斜带石斑鱼和棕点石斑鱼)进行了遗传多样性和系统发生关系的分析。研究结果显示, 13个微卫星标记共检测到了84个等位基因, 9种石斑鱼中的平均等位基因数、平均多态信息含量(PIC)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和平均Hardy-Weinberg遗传偏离指数(D)分别在2.69~5.38、0.1976~0.4267、0.4615~0.6239、0.3510~0.4754和0.1097~0.2836之间变动, 说明9种石斑鱼的遗传多样性都处于中等水平。用NJ法进行聚类分析的结果将9种石斑鱼分为3个支系：斜带石斑鱼、棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼为第1支; 青石斑鱼、赤点石斑鱼和七带石斑鱼为第2支系; 蜂巢石斑鱼、黑边石斑鱼和鲑点石斑鱼为第3支系, 该支系与第2支系的关系较近。本研究支持将宽额鲈(鞍带石斑鱼)归入石斑鱼属。     

赤点石斑鱼促甲状腺激素TSHβ启动子的克隆及其在斑马鱼胚胎原始性腺和垂体中定位表达

促甲状腺激素(Thyroid-stimulating hormone,TSH)具有调节生长,发育,代谢和生殖的功能,但是在低等脊椎动物中的功能研究较少。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)促甲状腺激素TSHβ除在垂体中表达外还在性腺中表达,进一步发现TSHβ也在赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)性腺中表达。且在人工诱导的赤点石斑鱼中,随着雄性化的转变,TSHβ转录水平升高。为研究石斑鱼TSHβ特殊表达方式的调控机制,采用基因组步移技术扩增获得赤点石斑鱼TSHβ5′端序列共5112bp。将1864bp核心片段顺向克隆到pBK-TOL2载体中,pTSHβ-TOL2重组质粒与转座酶mRNA共注射斑马鱼一细胞期受精卵。Western blot结果显示,在受精后10h的尾芽胚中可检测到GFP的表达,胚体晚期GFP表达量最高。荧光显微镜追踪观察发现,受精后12-30hpf(Hours post fertilization)观察到GFP在原始生殖细胞(PGC)区域表达;36hpf-7dpf观察到GFP除在PGC区域表达外还在垂体中表达。由此可见,赤点石斑鱼TSHβ5′端1864bp的序列具有特异定位的启动子活性。       

重组斜带石斑鱼生长激素及其抗血清在放射免疫测定中的应用

将斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)生长激素成熟多肽cDNA序列克隆到质粒pRSET,与6x组氨酸等原核编码序列融合获得重组质粒pRGH6,转入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达,表达量占细菌总蛋白的43％。免疫印迹证明表达产物为含斜带石斑鱼生长激素的融合蛋白,Ni^2 亲合层析柱纯化融合蛋白,以此为抗原免疫家兔制备特异性的抗血清。以纯化的重组生长激素和特异性的抗血清建立斜带石斑鱼生长激素的放射免疫测定法,该方法的灵敏度、特异性和重复性均达到测定血液生长激素的水平。研究了多巴胺的受体激动剂阿扑吗啡对静态孵育斜带石斑鱼脑垂体碎片释放生长激素的影响,结果表明,阿扑吗啡能以剂量依存方式促进斜带石斑鱼垂体释放生长激素。     

点带石斑鱼染色体显带技术及其描绘研究

点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)属于鲈形目, 科、石斑鱼亚科、石斑鱼属, 是中国东南沿海暖水性礁栖的名贵海产经济鱼类. 采用PHA活体注射结合秋水仙素培养, 取点带石斑鱼全肾, 低渗处理, 空气干燥制片法制作染色体标本, 利用Alu I 限制性内切酶介导的原位切口平移显带技术, 在点带石斑鱼有丝分裂中期染色体上诱导出带纹清晰、分散良好的多重带. 结果显示, 多数染色体显现出8-10条带纹, 最少的一对染色体也有4条带纹, 同源染色体带纹基本一致, 在每对染色体上的数目及其分布具明显特征性且相对稳定, 同时发现不同分裂相的同一号染色体上, 特征带纹鲜明一致, 带纹数目基本吻合, 具有可重复性和可操作性; 然后用人X和Y染色体文库特异DNA为探针, 对点带石斑鱼的有丝分裂中期分裂相染色体进行了描绘研究. 结果表明, 点带石斑鱼染色体组中测出了人X染色体特异DNA同源片段的3个保守同线群, 分别在点带石斑鱼的第7、第13和第22号同源染色体上, 它们的杂交信号最近边距着丝粒的百分比距离分别大约为62.3%、43.4%及44.4%; 人X染色质同源片段的大小约占点带石斑鱼基因组的4.63％. 但用人Y染色体DNA描绘点带石斑鱼染色体时, 没有检测出可见的同源片段. 研究结果可以为从低等脊椎动物到人类性染色体的进化过程提供一种新的研究思路.       

从细胞色素b部分序列探讨石斑鱼属的分子系统发育关系

石斑鱼的分类在学术界尚存在很多争议。本文采用PCR技术,测定了分布于中国的点带石斑鱼(Epinepheluscoioiaes)、青石斑鱼(E.awoara)、六带石斑鱼(E.sexfasciatus)、褐石斑鱼(E.brunneus),长棘石斑鱼(E.longispinis),吻斑石斑鱼(E.spilotoceps),巨石斑鱼(E.tauvina)以及石斑鱼亚科侧牙鲈属的侧牙鲈(Variola louti)的线粒体细胞色素b基因402bp的序列,结合GenBank提供的7种中国无记录的石斑鱼:青铜石斑鱼(E.aeneus)、海丰石斑鱼(E.haifensis)、犬牙石斑鱼(E.caninus)、东大西洋石斑鱼(E.marginatus)、白斑石斑鱼(E.multinotatus)、德氏石斑鱼(E.drummondhayi)、淡点石斑鱼(E.labriformis),把这14种石斑鱼作为内群,对他们的序列组成和结构特点进行了分析;并以同为科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)的侧牙鲈属(Variola)的侧牙鲈作外群,分别用MP法、NJ法对内、外群构建了分子系统树,结果表明:(1)14种石斑鱼402bp的mtDNA Cytb部分序列的碱基组成上,A+T的含量为53.6%高于G+C含量(46.4%),序列中转换颠换比为4.78,没有突变饱和;(2)青石斑鱼与六带石斑鱼、点带石斑鱼与巨石斑鱼、长棘石斑鱼与吻斑石斑鱼分别聚在一起,与形态分类结果一致;(3)系统树中,大西洋与太平洋种类各枝交替汇合,表明石斑鱼的Cytb序列有严格的保守性,也可能是协同进化的结果;(4)揭示在良种选配或遗传管理时,避免居于同枝的石斑鱼混交,将大西洋种类与太平洋种类杂交可能是遗传改良的一种途径。       

埋植17α-甲基睾酮诱导点带石斑鱼性转化技术

论述了埋植17α-甲基睾酮诱导点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)性转化的方法,包括药物的处理、用量、手术操作等．3龄的雌性点带石斑鱼经过2次埋植外源激素手术转化为功能性雄鱼,139d后58％可挤出精液,301d后100％可挤出精液．功能性雄鱼用于人工繁殖,亲鱼自然产卵。1999～2000年2年内共孵出仔鱼7103万尾．所得仔鱼用于鱼苗培育,得到发育正常的幼鱼．认为埋植外源激素诱导点带石斑鱼完成性转化的方法简便可行,能满足规模化人工繁殖的需要．     

秦岭细鳞鲑野生种群与人工养殖种群肌肉营养成分的差异

秦岭细鳞鲑(野生种群)是国家Ⅱ级重点保护水生野生动物。为了揭示野生种群与人工养殖种群的性状差异，科学区分秦岭细鳞鲑野生种群与人工养殖种群，本实验探究了秦岭细鳞鲑野生种群和人工养殖种群肌肉营养成分的差异。结果表明：野生种群和人工养殖种群的肌肉一般营养成分占比、脂肪酸组成及含量、矿物质和微量元素含量等均存在显著差异，而氨基酸组成及含量总体上无显著差异；野生种群肌肉中水分、粗蛋白和粗灰分含量显著高于人工养殖种群(P<0.05),粗脂肪含量显著低于人工养殖种种群(P<0.05);C_12:0仅在野生种群中被检测到，野生种群饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量显著低于人工养殖种群(P<0.05),K、Na、Ca、Mg、P、Zn含量显著高于人工养殖种群(P<0.05)。综上，肌肉脂肪酸组成及含量、矿物质和微量元素含量差异较大，可作为野生种群与人工养殖种群鉴定的依据，为秦岭细鳞鲑的保护与管理提供参考。     

斜带石斑鱼生长激素/催乳素家族基因cDNAs的分子克隆及其进化意义

从斜带石斑鱼垂体提取总。RNA,再取其50ng合成SMART cDNA。从所构建的垂体SMART cDNA质粒文库中筛选到生长激素／催乳素基因家族的2个成员的全长cDNA片段：生长激素(GH)基因全长为938bp,编码204个氨基酸;催乳素基因(PRI．)全长为1429bp,编码212个氨基酸。采用计算机软件Mega 2和CLUSTAL W1．64b对9种鱼的生长激素／催乳素基因家族的3个成员(GH、PRL和生长催乳素SL)的氨基酸序列进行系统分析,构建NJ分支系统树,对于序列中的插入／缺失位点则采用Pairaise Deletion,1000次自展(Bootstrap)分析计算各节点支持率。根据3个基因的氨基酸序列构建的系统树表明,石斑鱼与金头鲷、金鲈和牙鲆聚成一类,虹鳟与大马哈鱼聚成一类,鲫鱼与鲶鱼聚成一类,鳗鲡成另外一类。根据石斑鱼全长cDNA推断的氨基酸序列比较表明,SL相对GH和PRL有较高的保守性。石斑鱼的GH、PRL和SL的氨基酸同源性在24％～31％,但其C-端的氨基酸同源性较高,尤其是C-端的3个Cys是严格保守的。其中SL与GH的同源性(30．8％)高于与PRL的同源性(25．6％),GH和PRL的同源性最低(24．1％)。     

鲑点石斑鱼皮肤抗菌活性蛋白的纯化及抗菌活性(英文）

近年来在多种生物体中都发现有抗菌活性蛋白和多肽。由于其具有生物化学多样性,抗病毒、微生物、真菌、原生动物、肿瘤,促进伤口愈合等生物学活性,而引起研究者的极大兴趣。抗菌活性蛋白和多肽在动物的先天免疫中具有重要作用,它们直接作用于细菌,并将其杀死。鲑点石斑鱼(Epinephelusfario)是中国南方水产养殖中重要的海水鱼。近年来,由于细菌和病毒引发的病害造成鲑点石斑鱼大量死亡,但其抗菌活性蛋白及多肽目前还未见报道。本研究发现鲑点石斑鱼皮肤具有抗菌活性成分,鲑点石斑鱼皮肤匀浆物经胰蛋白酶水解后抗菌活性丧失,说明该活性是由蛋白质引起的。经离子交换层析及凝胶过滤层析,从鲑点石斑鱼皮肤中分离纯化到抗菌活性蛋白(Efap)。SDS-PAGE显示,Efap为单链蛋白,分子量约41kD。该成分能同时抑制革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、滕黄微球菌、枯草牙胞杆菌和革兰氏阴性菌,如溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。革兰氏阴性菌中,溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和多杀性巴氏杆菌对Efap较敏感,MIC<20mol/L,其他3种菌敏感性较差,MIC>20mol/L。另外,Efap显示出较强的抗金黄色葡萄球菌的活性,MIC为5—10mol/L。Efap的广谱抗菌性,说明其在鲑点石斑鱼免疫防御中具有一定的作用。