脂联素激活心肌细胞AMPK及p38MAPK通路

此荣获“第五届海峡两岸心血管科学研讨会”青年优秀论二等奖。作为北京大学医学部生理与病理生理学系吴立玲教授的在职博士生。[编按]     

五灵胶囊对LPS诱导鼠枯否细胞p38MAPK信号转导通路的影响

目的:探讨五灵胶囊对脂多糖(LPS)诱导的大鼠枯否细胞(Kupffer cells,KC)p38MAPK信号转导通路的影响。方法:分离纯化KCs,60ng/ml LPS刺激建立LPS的肝细胞损伤模型;40只SD大鼠药物处理后,分离制备含药血清。实验分为四组:空白血清组、LPS+空白血清组、含药血清Ⅰ组(10.0g/kg)+LPS、含药血清Ⅱ组(6.25g/kg)+LPS。KCs产生促炎因子(I125放免法测定TNF-α、IL-6、IL-8,比色法测定NO生成量),采用Western blot法检测ERK、p-ERK、p38、p-p38、TNF-α和STAT3的蛋白水平。结果:1、空白血清+LPS组,TNF-α、IL-6、IL-8和NO浓度明显高于空白血清组;2、同空白血清+LPS组比较,含药血清Ⅰ、Ⅱ组TNF-α、IL-6、IL-8和NO水平明显降低;3、与空白血清组比较,空白血清+LPS组能上调KCs对p-ERK、P38、p-P38、STAT3和TNF-α表达(p<0.01,p<0.05),对ERK表达无影响(p>0.05)4、同空白血清+LPS组比较,含药血清Ⅰ+LPS、含药血清Ⅱ+LPS组p-p38、S...     

皮质酮快速激活PC12细胞中p38丝列原激活的蛋白激酶

实验旨在研究糖皮质激素快速、非基因组作用的细胞内信号传导机制。Western分析研究结果表明,皮质酮可快速激活PC12细胞中p38丝列原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）,时间、浓度曲线均为钟形,最大激活为10^-9mol/L和15min。糖皮质激素受体阻断剂RU38486不能阻断此作用,而小牛血清白蛋白耦联的皮质酮也能快速激活p38。受体酪氨酸激酶阻断剂genistein对此作用无影响,表明此快速作用不涉及受体酪氨酸激酶活性。此作用能被蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）激动剂PMA模拟,而被PKC阻断剂Goe6976所阻断。结果表明,皮质酮可能通过推测的膜受体以PKC依赖的方式快速激活p38 MAPK。     

p38丝裂原活化蛋白激酶在不同细胞内定位的研究

用共聚焦显微镜对不同原代培养细胞的ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ,ＭＡＰＫ）进行定位,以探讨ｐ３８激活后入核在不同的细胞中是否具有普遍性。发现与单核细胞相似,未受刺激静止的心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的ｐ３８荧光强度呈弥散性分布;脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ,ＬＰＳ）刺激后,细胞核区荧光强度均明显增加,胞浆荧光强度均降低     

p38丝裂原素激活的蛋白激酶在调节低氧诱导人内皮细胞分泌血管内皮生长因子过程中的作用

血管内皮细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的合成增加在促进血管新生的过程中起着非常重要的作用.然而低氧诱导VEGF分泌的细胞内信号转导机制还不是很清楚.人脐静脉内皮细胞系(ECV304)在低氧或常氧的状态下培养12～24 h后分别用实时定量PCR和Western blot的方法来检测VEGF mRNA的表达及ERK1/2和p38激酶的磷酸化水平.分泌到培养液中的VEGF蛋白用酶联免疫吸附(ELISA)的方法来检测.业已报道,ERK的抑制剂PD98059能够抑制低氧诱导的VEGF基因的表达,根据这个报道,我们发现在低氧情况下,ECV304细胞的ERK1/2磷酸化水平增高以及VEGF的合成增加等这些变化也能被PD98059所抑制.本次实验的新发现是p38激酶的激活在低氧诱导VEGF合成增加中的作用.p38激酶的抑制剂SB202190能抑制低氧诱导的VEGF合成增加.这些数据首次直接证实了p38激酶在低氧诱导人内皮细胞分泌VEGF增加过程中的作用.     

p38丝裂原活化蛋白激酶的功能与调控机制

丝裂原活化蛋白激酶家族可以在一系列细胞外刺激下调控细胞的行为。作为该家族的四个亚家族之一,p38亚族在许多生理过程中扮演着重要角色。p38信号通路可以在紫外照射、热击、高渗透压、炎症因子、生长因子等细胞外刺激时被激活,调控细胞分化、细胞周期、炎症反应等多种生理过程。文章重点讨论了p38亚族各个成员的特性、该信号通路的组成部分、调控机制以及生物学功能。另外,还分析了p38与其他信号通路的联系以及对一些生理过程的影响。     

缺氧预处理对乳鼠心肌细胞蛋白激酶C活性的影响

在培养的乳鼠心肌细胞缺氧／复氧模型上,观察了缺氧预处理的细胞保护作用及其对细胞蛋白激酶Ｃ活性和蛋白磷酸化的影响。结果表明,ＡＰＣ可减轻心肌细胞的Ｈ／Ｒ损伤;提高细胞存活率,减少细胞脂质过氧化产物生成及细胞内乳酸脱氢酶和蛋白质漏出。模拟ＡＰＣ的短暂缺氧显著激活ＰＫＣ,使心肌细胞内分子量为６６ｋＤ和３１ｋＤ的蛋白条带＾３２Ｐ掺入增加;ＰＫＣ抑制剂Ｈ７完全消除ＡＰＣ对心肌细胞的保护作用,并抑制了短暂缺氧     

鼠体突变型p53外源基因的垂直传递和转位观察

外源基因用于制作转基因鼠并能成功地传递到子代已是不争的事实。但是,有关研究转基因的大小以及对其功能的影响却鲜见报导。本实验对体突变型p53基因－作为外源基因在172^Arg-Leu－体突变型p53基因的双转基因鼠家系中的遗传行为进行了研究。以体突变型p53基因的XhoI-ApaLI片段为探针,对雌性双转基因鼠＃4491及其子代进行Southern blot分析（Fig.2)。通过Betagen Meter测定,比较杂交膜上探针的吸附量得知：子鼠＃5074等体内的外源p53基因的拷贝数是其亲本34491的3倍。Fig.1为＃4491与雄性FVB鼠杂交后代的家系谱。杂交F1的子代中,那些外源p53基因拷贝数是其亲代（F1）3倍的鼠（如＃5071和＃668）、其后代中继续出现这种基因拷贝数的变化。取待测鼠＃5074的脾细胞制备染色体,经G染色,以WAP－双转基因－SV40连结p（A）的结构为探针,进行原位荧光测定。Fig.3表明：b所指的外源p53基因从所在的染色体上发生跳跃（jump in),出现在c和d所指的位置上。可能,整合在＃4491染色体上的外源p53基因有两组,一组是稳定整合的,传代时,可以被传递到所有子代上;另一组是非稳定整合的,由于一些未知因素,在传递过程中被扩增、并发生了跳跃现象。也许,特定位点上转基因的拷贝数有一个限量,适量则稳定;反之、则不稳定。     

p38 MAPK参与LPS诱导RAW细胞TNF—α基因表达的调控

构建ＴＮＦ－α启动子驱动的荧光酶报告基因系统,研究ｐ３８ＭＡＰＫ信号转导系统对ＴＮＦ－α基因表达的影响,ＲＡＷ２６４．７细胞共转染实验发现,ＬＰＳ对ｐ３８的激活作用与其诱导ＴＮＦ－α转录活性的作用显著相关,虽然单纯转染ｐ３８未见明显诱导ＴＮＦ－α报告基因系统的转录活性。     

脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶激活参与坐骨神经压迫性损伤所致神经病理性痛

本研究旨在观察脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）在坐骨神经压迫性损伤所致神经病理性痛中的作用。雄性Sprague-Dawley大鼠鞘内置管后,4-0丝线松结扎左侧坐骨神经制作慢性压迫性损伤（chronic constriction injury,CCI）模型。CCI后第5天,鞘内注射不同剂量的p38 MAPK特异性抑制剂SB203580,并在给药前及给药后不同时间点,分别用von Frey机械痛敏监测仪和热辐射刺激仪监测大鼠损伤侧后爪机械和热刺激反应闽值,用免疫印迹技术（Western blot）观察给药前后脊髓磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）和磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein,pCREB）表达变化。结果发现：坐骨神经压迫性损伤引起脊髓p-p38 MAPK蛋白表达明显增加;鞘内注射SB203580能剂量依赖性逆转CCI引起的机械性痛觉异常和热痛觉过敏及脊髓水平p-p38 MAPK表达的增加,也明显抑制CCI引起的脊髓pCREB表达的增加。结果提示,脊髓水平p38 MAPK激活参与坐骨神经压迫性损伤所致神经病理性痛的发展,其作用可能通过pCREB介导。     

食管鳞癌p53、c-erbB-2蛋白表达研究

为探讨p53、c-erbB-2蛋白表达与食管鳞癌生物学行为的关系,应用免疫组化LSAB法研究181例食管鳞癌中p53、c-erbB-2蛋白的表达。结果发现,正常食管粘膜均无p53、c-erbB-2蛋白的表达。47％食管鳞癌出现p53表达,p53阳性病例癌旁非典型增生上皮出现p53表达,p53阴性病例癌旁非典型增生上皮亦为阴性。p53阳性表达率与患年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级,临床TNM分期无关,且与预后无关。51.4%食管鳞癌呈现c-erbB-2蛋白表达,癌旁非典型增生上皮无c-erbB-2表达。c-erbB-2阳性率与肿瘤组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及肝转移有关,c-erbB-2阳性表达预后较差。结果提示,p53表达在食管鳞癌发生中起重要作用;c-erbB-2表达在食管鳞癌浸润转移中起重要作用。同时进行p53、c-erbB-2蛋白免疫组化检测,有助于对食管鳞癌进行早期诊断,监测病情和判断预后。     

LPS介导细胞激活的信号转导：从CD14到p38MAPK通路的研究

近年来对脂多糖（ＬＰＳ）介导细胞激活的信号转导过程已取得实质性进展,ＬＰＳ与血浆ＬＰＳ结合蛋白（ＬＢＰ）结合被运输到单核巨噬细胞表面,与ｍＣＤ１４受体结合起起细胞激活。ＭＡＰＫ参与了ＬＰＳ激活细胞产生肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）等活性物质的细胞内信号转导过程。ｐ３８ＭＡＰＫ对ＴＮＦ－α等细胞因子具有重要的调节作用。对ＬＰＳ激活细胞的信号转导研究呆能为治疗内毒素休克提供新的理论和思路。     

蛋白激酶C在小鼠卵母细胞体外成熟和受精中的作用

蛋白激酶是一类重要的丝/苏氨酸蛋白激酶。本实验以小鼠为实验动物,研究了PKC在卵母细胞体外成熟、活化和受精中的可能作用,及两种PKC亚型在卵母细胞中的定位。PKC激活剂PMA可以阻止CV期卵母细胞在体外恢复减数分裂,该作用可被PKC抑制剂calphostin C抵消,但不能被PLCγ抑制剂U73122或PKCδ专一性抑制剂Rottlerin所克服。Western印迹显示PKCα和βⅠ在卵母细胞发育过程中恒量表达。激光共聚焦显微术研究发现,受精或受到活化刺激后PKCα转位到卵母细胞膜上,同时皮质颗粒排放,说明PKCα可能参与调节卵皮质反应。本实验首次在小鼠中研究了PLCγ与受精的关系,发现不存在PKC对PLCγ的正反馈调节。此外,本研究还对小鼠卵巢中对PKCα和βⅠ进行了蛋白定位研究。     

巨噬细胞免疫调变信号:Raf-1,MAPK p44,MAPK p42和p38 MAPK的研究

为了了解巨噬细胞免疫调变机理,我们应用LPS和PMA处理小鼠抑制性巨噬细胞,观察到Ras下游信号分子Raf-1,分裂原激活蛋白激酶MAPK p44,MAPK p42和p38 MAPK均被活化,发现forskolin能增强p38 MAPK的活性,进一步提示PKC和PKA途径增强了p38 MAPK的磷酸化效应,为我们了解LPS如何激活p38 MAPK信号通路提供了一个新的机会。     

老年大鼠骨组织中c-fos和BMP表达的变化

目的：研究某些调节因子对骨组织老化过程的影响,方法：应用免疫细胞化学方法,检测大鼠骨组织骨形态发生蛋白（BMP）和细胞转录调节基因蛋白c-fos的表达和相互关系,以及BMP和c-fos蛋白表达的年龄关性变化。结果青年和老年大鼠股骨组织周围骨膜下的成骨细胞以及骨组织中的某些骨细胞BMP和c-fos蛋白呈阳性表达。而老年大鼠骨组织中,BMP和c-fos蛋白的表达明显下降。结论：老年大鼠BMP和c-fos蛋白的增龄性表达变化。可能会影响老年时期大鼠骨组织的形成和改建过程。     

大鼠面部伤害性刺激后纹状体边缘区内原癌基因c-fos和NOS的表达

为了研究纹状体边缘区和痛觉的关系,用c-fos和NADPH－d双标记方法研究了大鼠面部伤害性刺激后c-fos蛋白（Fos）和NOS在纹状体边缘区的表达。面部伤害性刺激后30分钟,边缘区中即出现Fos表达,刺激后3小时,Fos表达达最高峰,而且主要在边缘区部位表达。正常大鼠纹状体边缘区中有密集的NOS阳性神经元及纤维,面部伤害性刺激3小时后,纹状体其余部位的NOS阳性胞体及纤维减少或消失,但边缘区中仍保留,并可见少数Fos和NOS双标记细胞,提示纹状体边缘区可能和面部痛觉的调制有关。     

蛋白激酶C参与缺氧预处理的血管平滑肌细胞保护

已知缺氧预处理不仅对心肌细胞,而且对血管床亦有保护作用;但对血管壁细胞是否有直接保护作用,目前尚不清楚。本工作在培养的家兔血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）缺氧复氧（Ａ／Ｒ）损伤模型上观察缺氧预处理（ａｎｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ,ＡＰＣ）的影响。发现ＡＰＣ能提高Ａ／Ｒ后ＶＳＭＣ存活率,减轻细胞脂质过氧化损伤和钙超载,使用蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激动剂ＰＭＡ能模拟,而抑制剂Ｈ７或ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ能完全消除ＡＰＣ的上述保护作用。提示ＡＰＣ对ＶＳＭＣ的Ａ／Ｒ损伤具有保护作用,其机理可能与ＰＫＣ激活有关     

P38和ERK1/2在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨p38（mitogen-activated protein kinase p38,p38）和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular reg-ulated kinase 1/2,ERK1/2）在不同分化程度肝细胞癌（human hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达情况,以及两者的相关性。方法通过免疫组化（Envision）法,检测52例肝癌组织及l0例癌旁正常肝脏组织中p38和ERK1/2的表达。结果：p38和ERK1/2在肝癌组织中均有表达,与正常组比较差异有显著性,且阳性率的高低与其分化程度有关,p38在肝癌组织中的表达随分化程度的增高阳性率降低（P〈0.05）;ERK1/2在中、低分化的肝癌组织分别与高分化相比差异具有显著性（P〈0.05）。但低分化与中分化的肝癌组织比较虽也有差异但无统计学意义（P〉0.05）。癌组织中p38和ERK1/2的表达呈中度正相关（r=0.703,P〈0.05）。结论HCC中,p38和ERK1/2表达和活性增加,且存在一定的相关性。     

小鼠卵受精和人工激活过程中胞质游离Ca^2＋变化及其在卵激活中的作用

休止于第二次成熟分裂中期（ＭＩ）的小鼠卵母细胞分别乙醇,钙离子载体Ａ２３１８７、电刺激或精子激活并用Ｃａ＾２＋特异荧光探针－Ｆｕｒａ２／ＡＭ测定细胞内游离Ｃａ＾２＋的变化。结果表明,受精诱导ＭⅡ卵内游离Ｃａ＾２＋浓度多次跃升（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）乙醇,钙离子载体及１次电刺激仅诱导胞内Ｃａ＾２＋１次升高,人工诱导激活的卵可象正常受精卵一样卵裂并发育至囊胚,用ＥＧＴＡ阻止受精和人工激活过程中卵内游