新型大肠杆菌高效表达载体pHsh的构建与应用

在现代生物学和生物技术研究中,通过基因的重组表达获得目标蛋白是一种应用最广泛的方法。因其培养简单、操作方便、遗传背景清楚、克隆表达系统成熟完善,大肠杆菌表达系统通常是人们表达重组蛋白的首选,而表达载体在重组蛋白的生产中起决定作用。pHsh及其衍生质粒是近年发展起来的新型大肠杆菌表达载体,其调控外源基因表达的原理不同于所有其他表达系统,并且具有表达水平高、成本低廉等特点。介绍大肠杆菌表达系统的组成和常用表达载体,并对由pHsh系列载体组成的Hsh表达体系的构建策略、表达调控机制及其使用方法进行综述。Hsh表达体系的建立和发展有望从一个不同的角度帮助解决基因的重组表达中常见的表达水平低、诱导剂成本高、包涵体形成等问题。     

优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展

大肠杆菌表达系统是目前表达外源蛋白的首选,利用该表达系统表达重组蛋白有许多优越性,但表达的外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻击或未能正确折叠形成包涵体,其表达受到了限制。综述了国内外利用大肠杆菌表达外源蛋白过程中采用的一些优化策略,主要包括表达稀有密码子、应用融合标签,改变表达菌株、降低包涵体形成、单一蛋白技术、自诱导、流加培养以及高密度细胞培养等,以期探索外源蛋白表达的最优策略。     

食品级乳酸菌表达系统研究进展

乳酸菌表达系统是近几年发展起来的食品级高效表达系统。乳酸菌具有益生菌特征,因此该表达系统与其他细菌表达系统相比有很多优点。介绍了糖诱导表达系统、噬菌体Φ31爆发式诱导的表达系统、乳链球菌素调控表达系统、温控表达系统等的研究进展,以及这些系统的应用前景。     

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效表达外源基因的表达系统。综述了毕赤酵母表达系统的起源、生物学特性、融合蛋白的表达以及影响蛋白表达量的因素。     

酵母表达系统及其应用研究

酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具,拥有转录后加工修饰功能,适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比,酵母表达系统操作简便,成本低廉,可大规模进行发酵,是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。介绍了酵母表达系统的特点、常用酵母表达系统(载体和菌株)、酵母表达的一般步骤、实现高效表达的策略以及酵母表达系统的应用成果等。     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略

大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。     

恶性胸腔积液中肺腺癌细胞的EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1的表达及分子生物学意义

目的探讨EGFR、ERCCl、TYMS、TUBB3和RRMl在肺腺癌中的表达及分子生物学意义,为晚期肺癌患者的联合化疗提供参考。方法选取恶性胸腔积液中肺腺癌患者112例,采用免疫细胞化学方法对其进行EGFR、ERCCl、TYMS、RRMl、TUBB3的表达检测并根据EGFR不同的表达强度来统计ERCCl、TYMS、TUBB3和RRMl表达率的差异。结果在112例恶性胸腔积液中EGFR的阴性表达率为0．9％,弱阳性表达率为15．2％,阳性表达率为40．2％,强阳性表达率为43．7％,ERCCl的阳性表达率为40．2％,TYMS的阳性表达率为41．1％,TUBB3的阳性表达率为75％,RRMl的阳性表达率为83％。在不同EGFR表达强度下,ERCCl、TYMS和TUBB3各蛋白表达率不同且具有差异性。结论根据上述蛋白表达情况的不同,可对临床选择不同化疗方案提供参考意见。     

植物基因工程中人工启动子的研究进展

启动子是调控基因转录的一段DNA,也是构建基因工程表达载体的重要元件。天然启动子在表达强度和特异性等方面存在一定的局限性。采用人工构建的方法,有望得到诱导因子广、本底活性低、表达强度高、启动表达快等特点的启动子。本文综述了人工启动子在诱导表达、组织特异性表达、高效表达等方面的研究进展。     

运用组织芯片技术检测ndrg2、c-myc在人甲状腺肿瘤中的表达及分析

目的:检测ndrg2、c-myc在人甲状腺肿瘤中的表达,探讨ndrg2、c-myc在人甲状腺肿瘤中的表达模式.方法:运用甲状腺组织芯片,通过免疫组化染色,检测ndrg2、c-myc在人甲状腺肿瘤中的表达,并进行量化评分,分析ndrg2表达与c-myc表达两者之间可能存在的负调控关系.结果:ndrg2在甲状腺癌组织中呈阴性表达,在甲状腺腺瘤组织中呈弱表达或不表达趋势,在正常甲状腺组织中高表达.而c-myc在甲状腺癌组织中呈高表达,在甲状腺腺瘤组织中不表达或仅呈部分弱表达,在正常甲状腺组织中呈阴性表达.统计结果分析显示,ndrg2与c-myc在人甲状腺组织中的表达呈负相关.结论:ndrg2、c-myc在人甲状腺肿瘤中的表达呈负相关,由此推测NDRG2可能受到C-MYC的负调控.     

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键.毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质.简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展.     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的分泌表达研究

根据表达产物在大肠杆菌细胞中的定位,可将外源基因的表达分成胞内直接表达和分泌表达两种形式:其中分泌表达又可进一步分成周质分泌表达和胞外培养基外泌(excretion)表达两种方式。采用分泌表达可获得具有天然一级结构、正确折叠、组装的重组蛋白,但因表达水平低一直难以用于工程研究。近年来的研究表明,新生多肽链的跨内膜转运     

毕赤酵母表达系统

选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响其表达的因素等。     

提高动物乳腺生物反应器表达水平的策略

在转基因动物乳腺生物反应器研究中,组织特异性表达水平、表达率和表达定位性是决定性的指标。因此,高效表达乳腺生物反应器的制备是许多研究者要实现的目标,也是走向产业化的基本要求。本文从基因构件、动物基因转移方面叙述了如何提高乳腺生物反应器表达水平、增强表达特异性及表达率,着重探讨如何提高动物乳腺生物反应器表达水平。     

枯草杆菌表达系统的研究进展

枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性的良好的发酵基础,是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。本阐述枯草杆菌基因表达的一般特点、表达载体、表达类型以及分泌表达存在的问题。     

乳腺癌乙酰肝素酶、bFGF、VEGF的表达及其与肿瘤血管生成的关系

目的探讨乳腺癌中乙酰肝素酶、bFGF、VEGF的表达与乳腺癌血管生成的关系和意义。方法应用免疫组化SP法检测95例乳腺癌组织和20例癌旁正常组织中乙酰肝素酶、bFGF、VEGF和CD34的表达,并联合运用RNAi技术沉默乳腺癌细胞系MDA-MB-231乙酰肝素酶的表达,观察bFGF、VEGF的变化情况,分析乙酰肝素酶、bFGF、VEGF表达的意义以及其与乳腺癌血管形成、预后之间的关系。结果免疫组织化学染色证实乙酰肝素酶（64／95）、bFGF（72／95）和VEGF（65／95）主要表达在癌细胞质和（或）细胞膜中,在癌旁正常组织中则呈阴性表达。统计分析结果显示：乙酰肝素酶和bFGF、VEGF的表达具有明显的一致性,乙酰肝素酶阳性表达病例中bFGF、VEGF表达率明显比乙酰肝素酶阴性表达病例高,向人乳腺癌细胞系中转染乙酰肝素酶特异性siRNA,抑制乙酰肝素酶的表达后发现VEGF、bFGF的mRNA表达水平下调。乙酰肝素酶、bFGF、VEGF的表达与乳腺癌患者的肿瘤直径、临床分期、组织学分级、淋巴结转移及5年生存率密切相关,乙酰肝素酶和（bFGF／VEGF）共表达时与微血管密度的相关性比乙酰肝素酶单独表达更显著。结论乙酰肝素酶阳性表达与乳腺癌侵袭转移密切相关,乙酰肝素酶在乳腺癌中过度表达可能通过释放bFGF、VEGF促进肿瘤血管生成。     

不同日龄大白猪视黄醇结合蛋白基因的表达研究

采用半定量RT-PCR方法时大白猪的Retinol-Binding Proteins(RBP)基因在1、90、180、270、360日龄的心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫、卵巢共11个组织的表达情况进行了研究.结果表明RBP mRNA在肝脏、子宫和卵巢内持续表达.而且在肝脏中是持续高表达,子宫中RBP mRNA的表达在不同日龄间存在显著差异(P<0.05),且在90日龄时最低,脾脏不表达该基因,在胃里的表达时间较短,仅在1日龄时表达,心脏、肾脏、肺、大肠、小肠和肌肉组织中也表达RBP mRNA.但不同日龄不同组织的表达情况不一样,没有明显的规律性.但存在时间和空间的表达差异.     

小鼠不同组织及缺氧损伤后的大鼠心肌细胞中RIP3的表达

目的:检测小鼠组织中受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(RIPs)表达谱,并检测RIP3在大鼠心肌细胞缺氧损伤后的表达。方法:①采用荧光实时定量PCR分别检测RIPs家族基因在小鼠组织(心、肝、肺、肾、脑、小肠、骨骼肌、脾和主动脉)中的mRNA表达谱,并采用Western blot进一步检测RIP3在小鼠组织的蛋白表达谱。②将培养的大鼠心肌细胞分为缺氧组和对照组,缺氧组置于缺氧环境中培养48 h,采用western blot检测其中RIP3的表达变化。结果:①mRNA水平:RIP1 mRNA在脑组织中表达最高,心脏、肺、肾、骨骼肌较低;RIP2在心脏和肺表达量较其他组织高;RIP3在肠中表达较其他组织高出4倍以上,脑组织中未检测到RIP3表达;RIP4的表达以肺最高,而骨骼肌、脑和血管中表达量低。②蛋白水平:在小鼠组织中,RIP3表达以脑、骨骼肌中最高,心脏、肝、肺中表达较低。③培养的大鼠心肌细胞中,缺氧组心肌细胞的RIP3表达量显著高于对照组(P0.05)。结论:RIPs在小鼠组织中呈现差异表达,而在培养的大鼠心肌细胞缺氧损伤后RIP3表达升高。     

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。本文综述国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。     

TDGF-1在胃癌中表达的意义及其在上皮间质转化中的作用

探讨胚胎瘤衍生生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)在胃癌中表达的临床意义及其与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系.分别采用免疫组化SP法和逆转录-聚合酶连反应(RT-PCR)方法,检测胃癌组织和正常胃组织中TDGF-1、E-cadherin、Vimentin的表达情况(IHC70例;RT-PCR40例),分析TDGF-1表达与临床病理特征的关系及TDGF-1、E-cadherin、Vimentin三者表达的相关性.TDGF-1、E-cadherin、Vimentin蛋白在胃癌组织中的阳性表达率分别为70%、34.3%、52.9%,在正常胃组织中的阳性表达率分别为38.5%、94.3%、15.7%(P<0.05);TDGF-1、E-cadherin、Vimentin mRNA在胃癌组织中的阳性表达率分别为67.5%、37.5%、52.5%,在正常胃组织中的阳性表达率分别为35%、87.5%、22.5%(P<0.05);TDGF-1蛋白和mRNA的表达均与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P<0.05);TDGF-1高表达与E-cadherin表达减低显著相关(r=-0.447、P<0.05),TDGF-1高表达与Vimentin表达升高显著相关(r=0.318、P<0.05),E-cadherin表达减低与Vimentin表达升高显著相关(r=-0.283、P<0.05).TDGF-1可能通过调控E-cadherin、Vi-mentin表达促进EMT,从而在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用.