不吸水链霉菌11371衍生菌种构建及基因工程宿主菌初筛

采用物理、化学等方法对不吸水链霉菌11371(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp)进行诱变,获得78株在菌落形态方面与野生菌不同的衍生菌;并对各种衍生菌株进行了抗生素生物活性、内源性质粒以及外源载体转化等研究,初步筛选出2株具有宿主潜力的衍生菌,为构建11371转化体系提供了生物材料和相关理论基础。     

大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨

本文对４种大肠杆菌菌株在不同生长时期的转化效率分别进行了测定．结果表明,在细菌的生长繁殖过程中,其转化效率是有很大变化的．对于不同的菌株,它们获得高转化率时的活菌数不同．同时,得到了这４种大肠杆菌菌株制备最佳感受态细胞的条件．     

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。     

植物青枯菌细菌素的纯化及其性质的研究

用来自马铃薯、花生和甘薯上的17株菌作为指示萄,检测了另外17株青枯菌产生的细菌素;采用Eckhardl法和改良的Kado法检测了这些细菌素产生蘸的内生质粒。结果表明,青枯菌致病性菌株与它们衍生的相应的非致病性菌株所产生的细菌素具有相同的抑菌诺和抑菌强度,青枯菌细菌素的产生与其致病性之间没有相关性;B2、AM2、AP7、M2和P7等蘸株产生的细菌素不是由质拉编码的。     

亚硝化菌株的筛选及其初步鉴定

从化工废水和城镇污水生物处理反应器水中取样,用斯凯尔曼亚硝化假单孢杆菌培养基及硅胶平板分离得到4株可以利用氨氮生长的菌株,并对其形态和生理生化性状进行分析。初步研究结果表明。它们可能分属硝化菌、丝状菌和假单孢菌。在溶氧浓度大于1mg/L的液体培养基中,以上菌株能够将氨氮转化为NO2^-,基本没有NO3^-,又能将氨氮转化为气态氮,且水中NO2^0和NO3^-不再累积,分别保持在小于9mg/L和小于2．0mg/L的水平。     

电转化法构建变形链球菌UA159 comD缺陷菌株

目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因缺陷菌株,为进一步研究该基因功能做准备。方法根据同源重组原理,利用变形链球菌UAl59comD基因同源重组DNA片段,采用电击转化方法获取转化菌落,通过形态学观察、生化特性检测、PCR及测序、RT-PCR对缺陷菌进行鉴定。结果在含有红霉素（10μg/mL）的琼脂平板上出现转化菌落,鉴定结果均显示转化菌为comD缺陷菌。结论成功构建了变形链球菌UA159comD基因缺陷菌株。     

一株高效降酚菌的质粒特性及柠檬酸细菌表达的研究

在焦化废水处理厂的活性污泥中筛选的降酚效果较好的菌株H,研究其质粒特性并提取其降解质粒将其转入柠檬酸细菌进行表达。结果表明H菌株具有质粒,且质粒片段较大最大的超过10 kb,最小的2 kb左右。通过SDS和原生质体再生法分别对H菌进行质粒消除,结果发现质粒去除的菌株降酚能力也随之消失。说明H菌株的质粒上有控制酚降解基因存在;提取H菌的质粒将其转入柠檬酸细菌进行表达,获得了转化子。转化子具有较好的降酚效果12 h可达77.34%,但转化子的降解速率较小。另证明了转化子内含有与H菌株相同特性的质粒得到具有降酚能力的柠檬酸细菌表达体系。     

有益芽胞杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量,然后在不同的溶菌酶浓度下,对赖氨酸产量超过0.07g/L的21株菌进行原生质体转化质粒pUB110,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率,结果6103,6104,6120,6129四株菌的转化频率较高。然后,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株,使赖氨酸积累提高。其中,B. licheniformis 6104诱变菌株610401能积累赖氨酸2.91 g/L,比出发菌株提高了17倍左右,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验,进一步证实B.licheniformis 6104及其突变菌株610401是较好的受体菌,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。     

应用柱前衍生化高效液相色谱法开辟了一种简单、快速的DNJ产生菌的筛选途径

【目的】应用柱前衍生化高效液相色谱法筛选产1-脱氧野尻霉素(DNJ)菌株,并对其进行系统鉴定。【方法】利用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)柱前衍生化高效液相色谱法筛选DNJ产生菌;通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rRNA序列相似性分析等多项分类方法对DNJ产生菌进行鉴定;在10 L发酵罐水平进行发酵研究,利用FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法测定DNJ含量。【结果】从80株具有α-糖苷酶抑制剂活性的土壤放线菌中筛选得到一株DNJ产生菌,菌株编号为PW409,初步确定为戈壁三素链霉菌(Streptomyces gobitrici);发酵研究表明,DNJ为链霉菌PW409的次级代谢产物,发酵液中DNJ浓度为12.1 mg/L。【结论】首次将FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法应用于DNJ产生菌的筛选,并首次报道从戈壁三素链霉菌发酵液中鉴定到DNJ。     

一株转化大豆苷元为S-雌马酚菌株的筛选和鉴定

【目的】筛选一株可转化大豆苷元为S-雌马酚的微生物菌株,并对该菌株进行鉴定。【方法】在厌氧条件下采用抗生素抑制非目标菌生长并结合稀释涂平板法进行菌株分离,分离可转化大豆苷元生成S-雌马酚的肠道细菌,并对产物进行结构鉴定。之后通过16S rDNA序列分析,构建该菌系统进化树,结合菌体形态及菌落特征,确立该菌系统发育学地位。【结果】从大鼠肠道内筛选分离到一株可以将大豆苷元转化为S-雌马酚的革兰氏阴性兼性厌氧菌株LH-52(JN861767),16S rDNA序列测序结果 BLAST比对表明该菌株与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)相似度达到了99%,结合形态特征和生理生化实验结果鉴定该菌为奇异变形杆菌。根据HPLC保留时间、质谱、核磁共振等波谱数据分析确定产物为S-雌马酚。【结论】菌株P.mirabilis LH-52为首次筛选到的可转化大豆苷元为S-雌马酚的兼性厌氧菌,相对于文献报道的严格厌氧菌更适合于工业化生产。     

铜绿假单胞菌AS1.860萘降解质粒的转化

为进一步证明铜绿假单胞菌AS1.860菌株降解萘能力与质粒的关系,我们以菌株AS1.860作供体菌,AS1.860-30(B-2~-)作受体菌进行转化。转化子BS1.860CI具备了供体株的遗传特性,转化频率为8×10~(-8)。琼脂糖凝胶电泳和酶切图谱观察,二者质粒DNA迁移区段和酶切图谱相同,表明质粒与萘的降解及铜绿色素的产生有关。     

工业酵母菌株转化体系的建立

本文通过敏感度实验测定了工业酵母菌株SK—1、SPSC—1、NAN—27在不同的培养基上对G418及Cu^2 的敏感浓度,确定了3株工业菌株转化子的筛选方法。针对它们各自的生理生化、遗传特性,用改进的醋酸锂完整细胞转化和原生质体转化两种方法,分别建立了3株菌的转化系统,初步解决了工业酵母菌株转化的问题,并为下一步工业酵母菌株的代谢工程改造奠定了基础。     

有益芽孢杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量,然后在不同的溶菌酶浓度下,对赖氨酸产量超过0．07g/L的21株菌进行原生质体转化质粒pUB110,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率,结果6103,6104,6120,6129四株菌的转化频率较高。最后,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株,使赖氨酸积累提高。其中,B.licheniformis 6104诱变菌株610401能积累赖氨酸2．91g/L ,比出发菌株提高了17倍左右,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验,进一步证实B.licheniformis 6104及其 突变菌株610401是较好的受体菌,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。     

卡那霉素产生菌Kp958-4菌株中与抗菌素产生有关的质粒转化

当把质粒消除株Ko42-7作为受体菌株,把产生卡那霉素产生菌Kp958-4作为供体菌株进行DNA转化时,获得了具有产生卡那霉素和形成孢子能力的转化子Ko-p77。Ko-p77与Kp958-4的抗菌谱和所用六种溶剂系统中的Rf值相似。这表明,S.kanamyceticus菌株间的质粒DNA可以进行转化。     

产黄青霉转化载体pPIPKA的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究

以腐草霉素(phleomycin)抗性为选择标记,构建了用于青霉素生产菌—产黄青霉Penicillium chrysogenum的转化载体pPIPKA。 以此转化当前的青霉素生产菌株NCPC-10086,建立了高效的工业生产菌株的基因转化体系,转化效率最高达18个转化子/g DNA。对转化子进行了PCR及Southern杂交分析,结果表明,外源基因整合到了宿主的染色体上。     

异小杆线虫发光共生细菌两种型的生物学研究

异小杆线虫发光共生细菌两种型(初生型和次生型)的形态和绝大多数生理生化及血清学反应均相同。它们的主要差异表现在培养特征、稳定性及对线虫繁殖的作用性上。如初生型菌能使线虫在人工培养基上大量繁殖,次生型菌却不能;初生型菌不稳定,易转化为较稳定的次生型。但不同的初生型菌株其稳定性又有差别;在NBTA、EMB及麦康凯培养基上,两种型的菌落区别明显。此外,所有初生型菌都具有抗菌作用,次生型菌只有部分菌株具有此性质,而且前者的抗菌谱较后者广。不同菌株的初生型,其抗菌能力有差别。     

胆固醇转化菌株的筛选及发酵条件优化

【目的】从土壤中筛选及鉴定具有转化胆固醇能力的菌株SE-1,对转化产物进行结构鉴定,并通过一定的工艺条件优化提高转化产率。【方法】利用胆固醇为唯一碳源筛选能转化胆固醇的菌株SE-1,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S rRNA基因序列同源性分析确定该菌株的系统发育学地位。发酵转化产物经氯仿萃取,对转化产物进行硅胶板薄层层析法分析,用硅胶柱层析法、Sephadex LH20分离产物,通过1H-NMR、13C-NMR分析确定转化产物的化学结构。对菌株转化胆固醇的发酵培养基的碳源、氮源、底物添加方式及发酵条件进行优化。【结果】菌株SE-1为革兰氏阴性菌,生理生化特征与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)相似,16S rRNA序列与洋葱伯克霍尔德氏菌(GenBank No.U96927)相似性为99%。硅胶薄层层析显示转化产物为两种产物。发酵转化时,在胆固醇-吐温乳化液的添加量为1 g/L,碳源糖蜜5%,氮源(NH4)2SO40.3%,接种量4%,发酵液pH7.5,36℃发酵的条件下,7β-羟基胆固醇的产率最高,达到34.4%。【结论】分离得到的菌株SE-1鉴定为Burkholderia cepacia。菌株SE-1转化胆固醇的主产物为7β-羟基胆固醇,次产物为7-酮基胆固醇,胆固醇7β-羟基化转化率在最适的转化条件下比优化前提高了20.8%。     

不同动物肠道优势需氧菌对黄豆苷原转化菌株转化能力的影响

摘要: 【目的】探讨不同动物肠道优势需氧菌对黄豆苷原转化菌株转化能力的影响。【方法】有氧条件下,采用稀释涂布法分别从ICR 小鼠、芦花鸡、长白猪和獭兔等4 种健康动物肠道中分离优势需氧菌,将不同动物的优势需氧菌分别与不同类型黄豆苷原转化菌株进行厌氧混合培养,高效液相色谱检测培养液中黄豆苷原的转化情况。【结果】16S rRNA 基因序列分析,结合形态学及相关理化特性分析表明,分离的22 株优势需氧菌分属埃希氏菌属(10 株) 、变形菌属(5 株) 、肠球菌属(4 株) 、芽胞杆菌属(2 株) 和假单胞菌属(     

RNA干扰茄病镰刀菌ALP基因及其基因沉默菌株的制备

目的构建RNA干扰质粒载体抑制茄病镰刀菌碱性丝氨酸蛋白酶(ALP)基因,通过检测ALP的表达及酶活性变化筛选出基因沉默菌株。方法构建2个ALP的干扰载体,转化茄病镰刀菌孢子,获得ALP基因沉默菌株△ALP1、△ALP2,通过RT-PCR检测△ALP1、△ALP2的ALP基因mRNA变化,并通过蛋白琼脂廓清率培养基检测ALP酶活性变化,对所得菌株的毒力进行判断。结果 RNA干扰后所获基因沉默菌株中,ALP的mRNA表达量显著低于标准茄病镰刀菌株(F=184.67,P<0.01),其中ΔALP2抑制效果较好、酶活性显著低于标准菌株及△ALP1(q=5.276、5.463,P<0.01)。结论通过LiAc转化法对茄病镰刀菌ALP进行RNA干扰,可有效抑制茄病镰刀菌ALP的表达;ALP基因沉默茄病镰刀菌株的获取,为进行动物体内实验、深入研究ALP在茄病镰刀菌性角膜炎发病机制中的作用、探索新型治疗方法提供思路。     

一种真菌对人参皂苷Rg3的转化

[目的]筛选长白山人参土壤中的活性微生物,转化人参总皂苷及单体人参皂苷产生稀有抗肿瘤成份.[方法]从长白山人参根际土壤中分离各类菌株,对人参总皂苷及单体人参皂苷进行微生物转化,并通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化,采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定;结合菌落形态、产孢结构、孢子形态特征以及菌株ITS rDNA核酸序列分析,对活性菌株进行鉴定.[结果]从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株,有12株菌株对人参总皂苷有转化活性,其中菌株SYP2353对二醇组人参皂苷Rg3具有较强的转化活性.[结论]阳性菌株SYP2353被鉴定为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),能将人参皂苷Rg3转化为稀有人参皂苷Rh2及二醇组人参皂苷苷元PPD,为稀有人参皂苷Rh2的制备提供了新的方法.