EMSA法分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclin D1的相互作用

利用蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法（EMSA）分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclinD1的相互作用。探讨位于cyclinD1启动子区的－248到－220之间,该区域包含SATAT5与cyclinD1的结合序列TTN5AA。STAT5与cyclinD1共形成a、b两条蛋白滞后带,当用点突变的探针作用时,仅剩下滞后带a,因此滞后带b可能为STAT5与cyclinD1的特异性结合条带。     

JAK-STAT参与血管平滑肌细胞血管紧张素原和心钠素基因的转录激活

为探讨Janus蛋白酪氨酸激酶2-转导及转录激活因子5（JAK2-STAT5）途径在介导血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）血管舒-缩肽表达调节的作用及分子机制, 以Ang Ⅱ为诱发因素刺激培养的大鼠VSMC, 用免疫共沉淀、Western印迹分析和激光共聚焦显微镜观察STAT5磷酸化及其核转位, 用电泳迁移率改变分析（EMSA）确定STAT5与血管活性肽基因调控区顺式调控元件的结合活性. 结果显示, STAT5磷酸化水平分别于Ang Ⅱ刺激10 min和12 h出现两个高峰, 增加的磷酸化STAT5主要分布在细胞核内. Ang Ⅱ诱导的STAT5活化与核转位可被JAK2的特异抑制剂AG490所抑制. EMSA结果显示, 用Ang Ⅱ刺激VSMC后, 核蛋白与含有血管紧张素原基因启动子STAT5识别序列的探针结合活性显著升高,而核蛋白与含有心钠素（ANF）基因启动子STAT5识别序列的探针结合活性则呈下降趋势, 核蛋白与两种探针的结合活性均可被JAK2抑制剂AG490所消除, 并且加入抗STAT5抗体后均可出现滞后的超迁移带. 结果提示, Ang Ⅱ通过激活JAK2-STAT5介导信号向胞核内传递, STAT5与相应的顺式元件结合是启动血管紧张素原和心钠素基因表达所必需的转录调控机制之一.     

多头绒泡菌类cyclinB1蛋白在细胞周期中的变化

以自然同步化的多头绒泡菌（Physarum polycephalumL.)为材料,经抗cyclinB1抗体的免疫印迹和免疫电镜实验观察结果表明,多头绒泡菌中含有类cyclinB1蛋白,该蛋白的含量和细胞内位置在细胞周期进程中存在着动态变化。类cyclinB1蛋白在S期开始合成并在细胞质中积累,G2晚期开始进入细胞核,该蛋白在细胞质和细胞核中含量逐渐增加。有丝分裂中期时达最大值。后末期时骤然消失,在G2晚期到有丝分裂中期期间,类cyclinB1蛋白既是细胞核蛋白又是细胞质蛋白,细胞质是类cyclinB1蛋白的主要存在区域,细胞核中的类cyclinB1蛋白主要结合于染色体和核仁区域。     

人细胞色素c基因在大肠杆菌中的克隆和表达及活性测定

通过PCR方法 ,从人胎儿心肌基因组DNA中得到precytc基因 (有 1个内含子 ) ,剔除内含子后 ,得到细胞色素c基因的编码序列 .测序结果表明 ,该基因与GenBank中报道的人细胞色素c基因核苷酸顺序完全一致 .将其插入原核表达载体pET3a的NdeⅠ和HindⅢ位点之间构建pET3a cytc重组质粒 ,并成功转化入E .coliBL2 1(DE3)中 .经IPTG诱导表达后 ,15 %SDS PAGE分析 ,可观察到1条与细胞色素c蛋白分子量相符的电泳条带 .Western印迹结果显示 ,该条带与小鼠抗人cytc单克隆抗体IgG2b发生特异反应 ,证实为人细胞色素c的前体蛋白 .体外使血红素与该前体蛋白结合生成完整的人细胞色素c蛋白 ,其耗氧量在不同浓度具有与反应时间的线性关系 ,为研究人细胞色素c结构和功能关系奠定了基础     

基于量子点荧光共振能量转移（FRET）效应的裂开型CD20核酸适配体探针用于非霍奇金淋巴瘤的检测研究

目的:构建新型的基于量子点荧光共振能量转移效应的裂开型CD20核酸适配体激活式荧光探针用于非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma, NHL)的检测。方法:将CD20核酸适配体CE4-1进行裂解,结合量子点和Cy5荧光供受体队之间的FRET效应,利用流式细胞术,对裂开型核酸适配体的裂开位置、比例、浓度和反应时间进行优化,并在最优条件下评估该检测体系对CD20~+细胞的检测特异性。结果:将CD20核酸适配体CE4-1分别裂开成CE4-1-1a/CE4-1-1b和CE4-1-2a/CE4-1-2b两种组合,分别修饰量子点(QD)或荧光受体Cy5后两两组合,分别与CD20~+细胞孵育,流式细胞术发现CE4-1-1a/CE4-1-2b组合时信号最强;进一步,通过探索两种探针比例、探针浓度、孵育时间等参数,发现当CE4-1-1a和CE4-1-2b浓度比例为1:5、CE4-1-1a浓度为4 nM、孵育时间为50 min时,该裂开型核酸适配体体系显示出对靶肿瘤细胞最强的亲和力和FRET信号激活性能。进一步,实验发现该体系与CD20~+细胞(Raji和Ramos)可产生较强信号,而与CD20-细胞(Jurkat、K562、Min6和Hela)均未产生阳性信号,提示该探针可有效保持对CD20~+细胞的高特异性。结论:基于量子点荧光共振能量转移(FRET)效应的裂开型CD20核酸适配体探针体系在检测CD20~+细胞方面表现出了极低的背景信号,同时有着较好的FRET信号值,有望实现CD20~+NHL细胞的高灵敏激活式检测。     

AP-1与STAT5相互作用协同调节血管紧张素原基因表达

为研究AP-1和STAT5协同调节血管紧张素原基因表达的作用机制,用凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）和染色质免疫沉淀分析（ChIP assay）检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的AP-1和STAT5的DNA结合活性;用凝胶超迁移分析和免疫共沉淀方法观察AP-1和STAT5的相互作用. 结果显示,AngⅡ可分别促进AP-1和STAT5与血管紧张素原基因调控区顺式元件的结合以及二者之间的相互作用;核蛋白与含AP-1结合位点的寡核苷酸探针结合形成的复合物可与抗c-Jun抗体和抗STAT5抗体形成超迁移电泳区带;而用抗c-Jun抗体也可从STAT5 染色质免疫沉淀复合物洗脱液中检测到AP-1的存在. 而且,AP-1和STAT5的相互作用程度及其二者与DNA的结合活性与血管紧张素原表达活性具有一致关系,该效应可被JAK2特异抑制剂AG490所抑制. 上述结果提示,与顺式元件结合的AP-1和STAT5通过相互作用而形成四元复合物协同调节血管紧张素原基因的表达,JAK2对该过程具有诱导活化作用.     

黑曲霉(Aspergillus niger)纤维素酶系中内切β-葡聚糖酶性质的研究

对黑曲霉菌株W 25纤维素酶系中内切β-葡聚糖酶组分(1-2a、1-2b．1-2C、1—2d,I a．I b、Ia)的性质进行了研究。1-2a、1-2b、1-2c、1-2d、l a,1b和1a的最适pH分别为5．5、5．5、5 0、5．5、5．0、5．5和5．5;均在pH2．0～7．0之间稳定;最适温度分别为50、50、55、55、55和60(;保温1小时的半失活温度分别为49、61、63、52、57、47和67C。SDS-凝胶电泳法测得1-2a、1-2b、1-2c、1-2d、I a、Ib和Iia的分子量分别为53 000、48 000、57 000、60 000、44500、48 000和34 000。聚丙烯酰胺等电聚焦法测得其等电点分别为5．5、5．3、5．0、4．8、5．8、5．1和4．1。比较它们对羧甲基纤维素钠(CMC—Na)的糖化力及液化力表明,在作用方式的随机性上I-2b>I-a>I-2a>I-2e>-a>I-2d>Ib。在所测定的化学试剂中,Cu2+、Ag+和Hg2+对酶均确较强的抑制作用。     

脑缺血大鼠海马信号转导与转录激活子-3的激活及其调控

以往的研究表明,在脑缺血/再灌注的皮层和纹状体组织中信号转导与转录激活子-3(STAT3)被激活。本实验旨在研究SD大鼠四动脉结扎诱导的全脑缺血是否引起海马组织STAT3的快速激活及其调控机制。结果表明,脑缺血导致STAT3快速磷酸化激活及DNA结合活性增加。胞浆STAT3的磷酸化水平从缺血5min起就显著增高,10min达高峰(增加约1．7倍),然后开始下降。核内STAT3的磷酸化水平则逐渐增加,缺血30min时达高峰(增加约2．3倍)。电泳迁移率改变分析法显示,STAT3的DNA结合活性从缺血5min起就显著增加,30min达高峰(增加约3．2倍)。进一步的研究表明,缺血前20min腹腔注射给药,然后缺血30min,发现蛋白酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮和抗氧化剂N-乙酞半胱氨酸能显著地抑制核内STAT3的磷酸化水平及DNA结合活性的增加(磷酸化水平从2．3和2．5倍分别降为1．2和1．4倍,DNA结合活性则从2．8和3．7倍分别降为1．1和1．5倍),而蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂矾酸钠则能明显地促进他们的增高(磷酸化水平从2．0倍增到3．4倍,DNA结合活性从3．1倍增为5．1倍)。这些结果提示,蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶可能共同参与了缺血诱导STAT3的激活调控,STAT3的激活可能有助于海马神经元适应氧化应激。     

用抗独特型单抗体外诱发抗天花粉蛋白的二次抗体应答

在前阶段工作中已获得16个抗天花粉蛋白的单抗。用其中的一个IgE类单抗TE 1免疫Wistar大鼠,通过大鼠-小鼠杂交瘤技术得到了抗独特型单抗。现研究抗独特型单抗AId 6c5在体外诱发二次抗体应答中所起的作用。实验结果表明:1.当将AId 6c5和天花粉蛋白初次免疫8周后的小鼠脾细胞和肠系膜淋巴结细胞一起培养时,能引起二次抗体应答,说明AId 6c5能代替抗原的刺激作用,如果培养系统中同时存在AId 6c5和天花粉蛋白(其剂量能引起体外二次抗体应答),则可出现某种程度的抑制。由于AId 6c5是单克隆抗体,提示一种AId能在不同情况下起刺激或抑制作用。3.应用竞争结合试验阐明AId 6c5除和TE 1外,还和另外两个单抗——TE 4(IgE)和2 A1(IgG1)——起反应,先前的工作证明这三个单抗和另外4个单抗都识别天花粉蛋白上的同一抗原决定簇。但AId 6c5对识别这同一决定簇的其余4个单抗反应很弱。以上说明a.IgE和其它Ig类别具有共同或交叉的独特型,b.也说明识别同一决定簇的IgE具有不同的独特型。4.将TE 1等三个单抗和AId 6c5预先作用后能抑制这三个单抗和天花粉蛋白的结合,说明AId 6c5所识别的独特型,位于抗原结合部位内,至少??是很靠近抗原结合部位的。     

Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中的保护作用研究

目的:探讨Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中的作用。方法:构建pc DNA3.1-Homer1b/c质粒和Homer1b/c si RNA,过表达及si RNA干扰Neuro-2a细胞中Homer1b/c的水平,western blot分析观察上调及下调Homer1b/c后Homer1b/c的蛋白表达变化,再予细胞缺氧复氧损伤处理,观察细胞生存率、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放量及caspase-3活性的变化。结果:过表达及si RNA干扰Homer1b/c后,Homer1b/c的蛋白水平分别较正常组明显增高及降低(P值分别0.01),提示过表达及干扰Homer1b/c的效果均明显,分别能明显提高及降低Homer1b/c的水平。在缺氧复氧损伤条件下,Homer1b/c过表达组较空质粒转染组,其细胞生存率明显增加,LDH释放量、caspase-3活性明显降低(P值分别0.05);相反,下调Homer1b/c的水平后,与control si RNA转染组相比,细胞生存率明显降低,而LDH释放量和caspase-3活性明显增加(P值分别0.05)。结论:Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中具有神经保护作用。