菲律宾实蝇生物学特性研究

菲律宾实蝇Bactrocera (Bactrocera) philippinensis (Drew & Hancock)是重要的检疫性有害生物, 严重危害芒果Mangifera indica L.、木瓜Carica papaya L.和菠萝蜜Artocarpus heterophyllus Lam.等水果。本文在室内实验条件下对菲律宾实蝇生物学特性进行了较为系统的研究。结果表明: 菲律宾实蝇在6~18 h羽化率达93.93%。成虫活动、寿命、交配和产卵与温度、光照密切相关。补充营养能显著延长成虫寿命。菲律宾实蝇生长、发育和繁殖的适宜温度为25~30℃。25℃和30℃时平均产卵量分别为627.35粒和652.57粒。发育起点温度和世代有效积温分别为14.31℃和450.43日·度。温度与发育历期呈显著的负相关（r=-0.9005）。本研究为菲律宾实蝇的检疫处理和田间防治技术研究提供了重要的基础资料。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N（aminopeptidase N, APN）和钙粘蛋白（cadherin）是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles, BBMV）上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA（dsRNA）注入棉铃虫4龄幼虫体内, 以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。结果表明: 注射dsRNA（1 μg/头）进行基因沉默后, Haapn1 mRNA表达量比注射缓冲液（elution solution, ES）的对照下降了30%~49%, Ha_BtR mRNA表达量下降了30%~37%。注射Haapn1 dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm² Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫, 而在 100 和 170 μg/cm² Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异; Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。当同时注射Haapn1及Ha_BtR dsRNA后, 干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降。本研究进一步证明了棉铃虫Haapn1和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体, 这两种受体蛋白共同参与Cry1Ac的毒杀作用过程。该结果也提示, Haapn1或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70 (GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明：在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。     

黄粉甲抗冻蛋白AFP84a在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

为表达和纯化黄粉甲Tenebrio molitor抗冻蛋白, 采用RT-PCR方法扩增得到黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA, 将其连接到pMAL-p2X质粒上, 构建分泌型融合表达载体pMAL-p2X-afp84a, 并在大肠杆菌Escherichia coli TBI中表达; 进一步利用Amylose柱亲和纯化出该重组蛋白, 后利用细菌抗寒性检测重组蛋白的生物活性。结果显示: 融合蛋白含量占总可溶蛋白的40%。SDS-PAGE分析表明, 用MgSO4处理法与超声波细胞破碎法均可使融合蛋白从细胞中释放; 融合蛋白经Amylose柱亲和纯化, Factor Xa因子酶切, 电泳显示获得的目的蛋白呈单一条带。细菌抗寒性检测表明该重组蛋白具有较高的抗冻活性。黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA的克隆、 原核表达为进一步研究抗冻蛋白的性质和应用提供了有用的实验材料。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的分子进化分析

过PCR方法获得家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（egt）片段,序列分析表明该片段带有EGT的完整ORF,推测的多肽可形成EGT结构域的高级结构。为了研究egt的起源,利用家蚕基因组数据库,电子克隆了多个家蚕尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）基因,在此基础上进行了进化分析,表明BmNPV的EGT为antennal-enriched型UGT;推测核型多角体病毒（nucleopolyhedrivirus,NPV）和颗粒体病毒（granulovirus,GV）的egt基因在进化上来源于昆虫的UGT基因,但GV的egt基因在进化上的起源可能要早于NPV的egt基因;可能在昆虫祖先种进化形成不同昆虫目的某一时期,杆状病毒的祖先种从昆虫中获得了antennal-enriched型UGT基因,并进化为egt基因。家蚕的部分UGT基因与转座子元件连锁的基因组结构特点反映了杆状病毒的egt基因可能通过转座子的传递而获得。     

棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析

为了建立棉铃虫Helicoverpa armigera性染色体的特异性分子标记,利用RAPD-PCR技术对雌雄棉铃虫基因组DNA进行筛选,从500种随机引物中筛选到1 条引物（Operon编号为AF-18）,可扩增出1条约450 bp 的雌性特异片段。经克隆测序并合成特异引物进行验证,表明该片段为棉铃虫雌性特异分子标记,位于W染色体上。利用家蚕、果蝇等昆虫Kettin基因序列,克隆了棉铃虫的同源基因HaKettin片段,并采用荧光定量PCR技术,以棉铃虫的DH-PBAN基因为参照基因,检测棉铃虫雌雄不同个体间HaKettin基因与DH-PBAN基因的拷贝数之比,结果表明：雄体HaKettin∶DH-PBAN=1.0,雌体HaKettin∶DH-PBAN=0.5,据此推断HaKettin基因位于棉铃虫Z染色体上。     

米蛾体内Wolbachia的wsp基因序列测定与系统发育分析

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生菌, 它们参与多种调控寄主的生殖活动机制。通过对wsp基因的特异性扩增和测序,发现了Wolbachia在米蛾Corcyra cephalonica (Stainton)体内的感染。利用所测序列和其他已发表的序列建立系统树,结果表明米蛾体内Wolbachia属于B大组的Pip类群,与其寄生物茧蜂及赤眼蜂中的Wolbachia各株系遗传距离相差较远。据此推测米蛾体内感染的Wolbachia不是由寄生物（茧蜂、赤眼蜂）水平传播所致。     

中国菲寄蝇属分类研究(双翅目: 寄蝇科)

经研究发现中国菲寄蝇属现共有9种,其中包括4新种：金额菲寄蝇Phebellia aurifrons sp. nov.,褐粉菲寄蝇Ph. fulvipollinis sp. nov.,宽叶菲寄蝇Ph. latisurstyla sp. nov.和毛基节菲寄蝇Ph. setocoxa sp. nov.。我国新记录3种：叶蜂菲寄蝇Ph. clavellariae (Brauer & Bergenstamm),灰粉菲寄蝇Ph. glauca (Meigen)和拟灰粉菲寄蝇Ph. glaucoides Herting。本文除详细描述新种特征及绘制特征图外,还提供中国菲寄蝇属已知种类的分种检索表。     

基于ITS-1基因的菜粉蝶地理种群遗传分化研究

为了探讨我国不同地区菜粉蝶种群之间的遗传分化情况, 本研究运用克隆测序法, 对我国16个地区79只菜粉蝶Pieris rapae rDNA的ITS-1基因序列进行测定并分析; 同时, 以东方菜粉蝶Pieris canidia为外群, 重建了它们的系统发生树, 初步探讨了它们的生物地理学分化格局。序列分析结果显示: 所测菜粉蝶的ITS-1序列长度介于337~458 bp之间。经序列比对后, 在347个位点中共有281个保守位点, 63个变异位点, 16个简约信息位点和47个单突变位点; AMOVA软件分析其核苷酸多态性指数(nucleotide diversity) Pi为0.014, 每位点Theta (per site) Eta为0.041, 遗传分化指数(F_ST)为0.351 (P<0.05); DnaSP软件共检测出48个单倍型(haplotype)序列, 单倍型多样性(haplotype diversity)的频率为0.989。系统发生分析结果表明: 现存的菜粉蝶各地理种群与其地理分布没有直接的对应关系根据系统发生树结果推测, 该蝶种在我国的最早建群可能发生于辽宁、内蒙古及北京一带, 其后, 通过幼虫寄主植物的水陆运输以及成虫的迁飞向我国的不同地区扩散。     

灰飞虱体内WO噬菌体和Wolbachia的侵染关系

WO噬菌体是侵染节肢动物体内感染的Wolbachia的细菌病毒, 人们推测WO噬菌体可能参与了寄主遗传变异的过程。我们对采自中国境内4个地理种群（上海闵行、 云南普洱、 山东济宁和宁夏青铜峡）的灰飞虱Laodelphax striatellus 1~2龄若虫用抗生素HCl-tetracycline处理过的水稻饲养, 每隔20 d取样测定并比较其体内Wolbachia和WO噬菌体的感染率, 以此来初步研究灰飞虱体内WO噬菌体与Wolbachia的侵染关系, 结果表明: WO噬菌体感染率的变化趋势与其宿主Wolbachia的基本一致, 都随着时间推移逐步下降。我们进一步对未经HCl-tetracycline处理的灰飞虱, 用实时定量PCR的方法对WO噬菌体和Wolbachia在不同日龄灰飞虱雌虫体内的菌量进行测定, 结果显示, 二者菌量都随着日龄的增长有所变化, 在第8天达到最大, 二者的变化趋势基本一致。由此我们推断WO噬菌体是侵染胞内共生菌Wolbachia的专性病毒, 并且感染Wolbachia的WO噬菌体很可能是溶原性的噬菌体。     

大分舌蜂营巢生物学

于2009和2010年对广东河源大分舌蜂Colletes gigas的巢穴结构及生物学习性进行了初步研究。对分布在同一区域大分舌蜂的巢穴进行了挖掘, 详细记录了两个巢穴的结构; 挖出的卵、 幼虫及蛹的形态进行了解剖镜和电镜观察, 并做了简要描述。另外, 还通过分子及形态学方法对与大分舌蜂共用筑巢场所的另一种分舌蜂进行了鉴定。研究发现大分舌蜂喜欢在沙土中筑巢, 并且有集中筑巢的习性。大分舌蜂的巢穴由一条主道和几条虫室道组成, 虫室建在主道及各个虫室道的末端。大分舌蜂往年的巢穴可以被翌年羽化的大分舌蜂再次利用, 沿主道重新建造自己的虫室道或扩展原有的虫室道。大分舌蜂在中国南方专性取食山茶科植物尤其是油茶的花粉及花蜜, 蜂粮由于花蜜含量较多而呈液体状。通过进一步比较COI与28S D2区数据, 甄别出同一巢区中还存在另一种分舌蜂属物种, 表明大分舌蜂可以与另一种分舌蜂Colletes sp.共用筑巢场所。     

利用ENFA生态位模型分析玉带凤蝶和箭环蝶异地放飞的适生性

活体蝴蝶异地放飞存在潜在的入侵风险。本文采用生态位因素分析（ENFA）模型分析包括气候、地形、生境结构、植被类型、人类活动在内的影响玉带凤蝶Papilio polytes Linnaeus和箭环蝶Stichophthalma howqua(Westwood) 两种放飞蝴蝶分布的生态地理变量,模拟其在中国的适宜生境,评估其入侵风险。对现有分布记录的分析表明： 影响这两种蝴蝶分布的主要环境变量与其生态学特性相一致,且影响其扩散范围的主要因素为年总积温和冬季低温等;同时,人类活动的干扰对其分布影响很大。根据适生性图推测,这两种蝴蝶的适宜生境大部分重叠,主要集中在中国大陆中部及东南部,其扩散趋势由东南向西北发展。为防止活体蝴蝶放飞带来的潜在入侵风险,根据不同适生等级提出：HSI≥50的地方,不能开展室外放飞;5≤HSI<50的地方,可采取限制性室外放飞; HSI<5的地方,可进行自由室外放飞。     

旋幽夜蛾迁飞的雷达观测和虫源分析

旋幽夜蛾Scotogramma trifolii Rottemberg是我国北方农牧地区局部暴发为害的农业害虫,近年来危害逐渐呈上升趋势,但目前的研究对其大范围发生危害规律及是否具有迁飞性尚缺乏明确的认识。本文利用垂直监测昆虫雷达和相关辅助设备的长期自动观测和基于GIS的地理信息系统分析,研究了2005年吉林省白城地区通榆县和大安市旋幽夜蛾暴发的虫源性质及成虫空中飞行参数。结果表明：白城地区5月中旬20 cm的平均地温并不满足越冬代蛹羽化的最低温度;2005年5月下旬成虫盛发期东北、华北地区空中风场以南风和偏南风居多,为成虫迁入提供了有利的运载气流。6月下旬雷达观测点卵巢解剖显示,雌蛾卵巢发育进度整齐、级别较低,具有典型的迁出昆虫生理特征。雷达观测显示,成虫飞行最高可达距地面1 000 m, 主要选择在距地面300～500 m高度段,在500 m高度可以整夜飞行。初步判定旋幽夜蛾具有迁飞特性,这一发现为进一步认识其发生规律以及提高其预测预报水平提供了科学依据。     

尼日利亚西南部奥孙河沿线黑蝇Simulium damnosum Theobald complex的形态分类研究(双翅目: 蚋科)（英文）

黑蝇Simulium damnosum sensu lato是由多个姊妹种组成的复合体,这些种在生态学和盘尾丝虫病的传播方面各不相同。本文对奥孙河沿线的尼日利亚西南部森林区域的黑蝇S. damnosum s.l.复合体的组成以及成虫的形态学特征进行了研究。本研究所用的黑蝇S. damnosum s.l.成虫标本来源于奥孙河沿线的3个区,分别是Osun Eleja, Osun Ogbere和Osun Budepo。标本采集通过人体诱捕的方式,采集时间从2008年2月至2009年6月上午7:00到下午6:00,每两周采集1次。通过观察成虫的翅毛簇（wing tufts）和其他形态特征,对其进行分类研究。结果表明：存在同域分布的森林种和稀树草原种。在奥孙河沿线3个区内,森林种为优势种,占总捕获量的99.18%,而稀树草原种仅占0.82%;森林种和稀树草原种在多度上存在显著差异(P<0.05)。所捕获的所有稀树草原种的翅毛簇均为灰白色,而捕获的森林种的翅毛簇颜色存在显著差异(P<0.05)。为了更清楚地揭示该地区黑蝇S. damnosum s.l.的物种组成,建议进行更深入的研究。     

基于SAFLP的我国常见索线虫科昆虫病原线虫亲缘关系分析

本研究建立并优化了索线虫科(Mermithidae)SAFLP体系,构建了我国常见索线虫科昆虫病原线虫6属11种/亚种的指纹图谱。采用EcoRⅠ和MseⅠ两种限制性内切酶单酶切,结果显示EcoRⅠ酶更适合作为索线虫科线虫SAFLP的内切酶。3个带有3个选择性碱基的EcoRⅠ引物进行扩增共得条带225个,片段大小为250～1 650 bp。通过NTsys-PC2.1软件计算了索线虫科6属11种/亚种的Nei-Li遗传距离(0.1980～034554)和相似系数,利用NTsys-PC2.1软件中的UPGMA方法构建其聚类图。索线虫科这6属11种/亚种从属级阶元可以分为两大类群：罗索属Romanomermis和八腱索属Octomyomermis聚为一支构成第一大类群;六索属Hexamermis与卵索属Ovomermis先聚在一起然后与多索属Agamermis聚在一起,再与两索属Amphimermis聚在一起构成第二大类群。在八腱索属和两索属中属内不同种/亚种间线虫采集地相距较近的其遗传距离较近。优化的索线虫科线虫SAFLP体系能够反映索线虫科线虫种属间的亲缘关系,并与形态学的研究结果基本相符,可以用于属种的分类和亲缘关系的研究。     

苔原鼩鼱(Sorex tundrensis)在中国分布的首次证实

2008 年8 月利用陷阱法在内蒙古额尔古纳国家级自然保护区获得了4 号鼩鼱类标本,个体皆小, 尾长小于32 mm,貌似姬鼩鼱,颅全长在16. 50 ～17.24 mm 之间,大于姬鼩鼱(15 mm)。为了确证该4 号标本的物种类型,本文测定了它们的线粒体细胞色素b (Cyt b)基因全序列,结合从GenBank 下载的鼩鼱类序列构建系统进化关系。发现测定序列和下载苔原鼩鼱序列很好地聚在一起并形成单系。标本间及与下载的苔原鼩鼱间遗传距离小。从分子角度确证了标本为苔原鼩鼱,证实了苔原鼩鼱在中国的分布。本文对标本进行了描述。     

白头叶猴日活动时间分配及其季节性变化

<正>活动节律和活动时间分配是动物行为学研究的两个重要方面,它们直接与动物的代谢和能量收支相关,但它们又会随环境不同不断调整。通过比较不同生态条件下动物的活动节律和活动时间分配,     

Interruptin B对小菜蛾和亚洲玉米螟幼虫的拒食活性及对斜纹夜蛾卵巢细胞的毒力

为了研究Interruptin B的杀虫活性, 初步探讨其杀虫作用机理, 本研究采用叶碟法和叶片浸渍法测定了Interruptin B对小菜蛾Plutella xylostella和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 3龄幼虫的拒食活性和毒杀活性; 采用注射法和血球计数法研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫血细胞数的影响; 采用四甲基偶氮唑盐［3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT］法测定对斜纹夜蛾卵巢细胞(SL细胞)的增殖抑制作用; 采用倒置显微镜观察对SL细胞形态、密度和贴壁率的影响。结果显示：处理后48 h, Interruptin B对亚洲玉米螟和小菜蛾3龄幼虫的拒食中浓度(AFC₅₀）分别为108.56 和143.88 μg/mL, 致死中浓度(LC₅₀）分别为346.23和194.32 g/mL; 处理后24 h和48 h, 对SL细胞的抑制中浓度(IC₅₀）分别为13.51和4.11 g/mL。Interruptin B处理SL细胞后12-48 h, 细胞密度随时间的延长而下降, 与对照差异显著(P<0.05）; 处理后3, 6, 12, 24和48 h, SL细胞变形率分别为28.18%, 83.90%, 85.18%, 93.93%和100%, 细胞贴壁率分别为96.59%, 89.90%, 83.18%, 5.06%和1.09% , 处理后6-48 h, SL细胞变形率和贴壁率与对照差异显著(P<0.05）。Interruptin B对小菜蛾和亚洲玉米螟3龄幼虫具有良好的拒食和毒杀活性, 能显著降低斜纹蛾幼虫血细胞数量, 对SL细胞具有良好的增殖抑制作用, 可显著降低SL细胞生长密度, 改变细胞形态, 降低贴壁率, 表明该化合物可通过影响昆虫细胞活力毒杀活体昆虫。