家蚕浓核病毒(镇江)株主要结构蛋白基因的克隆及表达

家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)是一种昆虫细小病毒.与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同,家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞,感染该病毒细胞的细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染,在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加,形成褶皱,最后感染细胞脱落到肠腔中[1-3].自从20世纪70年代末日本学者证实家蚕浓核病是由于家蚕浓核病毒感染引起的以来[4],已经分离得到了多个病毒株系[5-8].根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异,分为BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-2(以山梨株为代表)[8-11].     

细胞周期蛋白B1、D1和E真核表达载体的构建及表达

目的：为研究细胞周期蛋白（cyclin）在肿瘤形成过程中的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白B1、D1、E的真核表达载体,并检测其在293T细胞中的表达。方法：以乳腺cDNA文库为模板,分别扩增细胞周期蛋白B1、D1、E基因全长编码区序列,克隆到pcDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染293T细胞,检测细胞中的FLAG融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-Cyclin真核表达载体,Western印迹分析表明克隆的载体都能在真核细胞中表达分子大小相符的重组蛋白。结论：构建了FLAG-CyclinBl、FIAG-CyclinDl、FLAG-CyclinE真核表达载体,为细胞周期蛋白及其相关蛋白的研究奠定了基础。     

家蚕整合素Bmintegrin β1基因的克隆及表达

整合素作为一种跨膜糖蛋白,与生物体的生理和病理等多个过程密切相关。为了探究其在家蚕中扮演的角色,通过PCR及RACE技术克隆得到了家蚕整合素β家族成员Bmintegrinβ1,通过结构域预测网站对其结构域进行了预测,并构建进化树对其进化关系进行分析,此外通过原核表达系统及蛋白纯化方法获得其重组蛋白,使用重组蛋白免疫小鼠获得其多克隆抗体,并采用半定量PCR及Western blotting方法检测Bmintegrin β1的时空表达。文中得到家蚕整合素Bmintegrin β1的3种剪切形式,且这3种剪切体具有长为2 502 bp的开放阅读框架,编码833个氨基酸。根据预测该蛋白含有Integrin-B-tail、跨膜区等一系列整合素家族保守的结构域。进化树结果表明该蛋白与同为鳞翅目成员的烟夜蛾和黑脉金斑蝶的整合素蛋白最为接近。此外我们通过原核表达系统及亲和层析技术获得了高纯度的Bmintegrin β1蛋白,进一步制得多克隆抗体。并通过免疫印迹反应证明该抗血清能特异识别Bmintegrin β1重组蛋白。之后通过半定量PCR及免疫印迹检测,结果显示该蛋白在家蚕的各组织以及血细胞各时期均有较高表达且在血液中表达量最高。总之,这项研究为家蚕整合素家族的研究提供了基础。     

家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列,利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征;其次,利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树;最后,通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期(卵、1～5龄幼虫、蛹、成虫)的表达水平,结果显示,克隆获得了siwi1 cDNA全长3 277 bp,包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR,获得了siwi2的部分序列,其中siwi1对应BmPiwi,siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示,家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactro...     

茶树细胞周期蛋白基因的克隆与表达

以茶树萌动芽为材料,采用SMART-RACE PCR技术从茶树萌动芽中获得了茶树细胞周期蛋白基因的全长cDNA序列(命名为CsCYC1),并用实时定量PCR方法(qRT- PCR)研究了该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同阶段的表达模式.结果显示:(1)该基因全长1956 bp,包含1320 bp的开放阅读框(ORF),编码439个氨基酸残基.(2) CsCYC1预测分子量为49.35 kD,具有细胞周期蛋白家族典型的保守cyclin-box结构域和三维结构.(3)系统进化分析结果表明,CsCYC1的氨基酸序列与葡萄、蓖麻、毛果杨、琴叶鼠耳芥、拟南芥等的相似性分别为77％、74％、72％、68％和67％.(4)实时荧光定量PCR分析显示,CsCYC1基因在茶树越冬芽休眠期的表达量远低于恢复生长期,在萌发期表达量最高,说明该基因与茶树越冬芽休眠的解除关系密切.     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

采用PCR方法克隆了家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJstrain)的酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因(ptp) ,测定了该基因的核苷酸序列 ,比较了与相关病毒相应基因的同源性 ,并将该基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,编码 16 8个氨基酸残基的蛋白多肽 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酶酯催化部位的“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV) ptp 基因和BmN PV -T3 株 (日本 )拟为的 ptp基因核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 % ,蛋白质氨基酸序列的同源性分别为 97 0 %和 97 6 %。将该基因插入到温度诱导型表达质粒pBV2 2 1的温控启动子PRPL 之后 ,在大肠杆菌JM10 9中表达了具有催化活性的蛋白质 ,分子量约为 19kD ,表达产物能催化对硝基酚磷酸钠 (PNPP)的脱磷酸反应 ,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCl2 抑制     

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα73B的克隆与表达

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,在生物中参与了广泛的信号转导途径,如光、神经递质和激素等。为了研究G蛋白在家蚕Bombyx mori中的生理功能及其作用机理,我们运用生物信息学方法在已有的家蚕基因组数据库中找到了一段与G蛋白alpha亚基（Gα）同源性很高的序列。通过设计特异性引物,运用PCR和RACE技术,成功地克隆了一个家蚕Gα基因的全长cDNA序列。该基因全长1 509 bp (GenBank登录号：EU914850),开放阅读框（ORF）为1 158 bp,编码385个氨基酸。Blast和DNAstar等软件分析发现该基因编编码的蛋白质与其他物种已知的Gα具有一定的保守性,将它命名为BmGα73B。RT-PCR扩增检测该基因在家蚕不同组织器官和不同发育时期的转录表达活性,结果表明它在不同发育时期的家蚕各组织器官中都有表达。从组织水平上看,BmGα73B在中肠中表达量最高,在马氏管、头部和神经索等组织中也有适量表达。在家蚕的不同发育时期中,转录水平峰值出现在幼虫期,在蛹早期也有适量的表达,而在预蛹期、蛹后期和成虫期几乎没有表达。结果说明BmGα73B可能参与了家蚕生长前期的中肠发育过程,为进一步研究G蛋白在家蚕发育过程的作用奠定了一定的基础。     

家蚕先天免疫基因 Bmimd 的克隆、表达及序列分析

昆虫的先天免疫应答由一组基因通过级联网络调控实现。果蝇 Drosophila 免疫缺陷(immune deficiency, imd)基因在体液免疫信号传递途径中起着重要的作用。我们利用生物信息学方法进行电子克隆,成功地找到了 imd 基因在家蚕 Bombyx mori 中的同源体,命名为 Bmimd。该基因全长1 092 bp,由 4 个外显子和 3 个内含子组成,开放阅读框(open reading frame, ORF)长 750 bp,编码 250 个氨基酸,预测蛋白质分子量为 28.6 kD。Bmimd 序列中含有一个致死结构域,经聚类分析表明该结构域与哺乳动物的受体相互作用蛋白(receptor interacting protein, RIP)相似。将该基因亚克隆到 PET-50b 载体进行原核表达,表达出了带有 2 个 6×His tag 和 1 个 Nus·Tag 标签的重组蛋白。Western blotting 结果表明 Bmimd 蛋白在 5 龄 4 天家蚕的头、脂肪体 、生殖腺、表皮和中肠中都有表达,但丝腺中没有检测到表达。     

家蚕滞育激素基因的克隆

利用放射性同位素３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记家蚕滞育激素ｃＤＮＡ作为探针,从家蚕基因库大约４×１０~５个噬菌体斑中筛选得到３０个阳性克隆,其中３个克隆具有相同的限制性内切酶图谱,并测知插入ＤＮＡ约１８ｋｂ,用限制性内切酶ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ切割,进行次克隆。用ＴａｑＤｙｅｐｒｉｍｅｒ序列测定法,得到部分核苷酸序列,经比较,鉴定了这３个克隆确属滞育激素基因。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,推定家蚕滞育激素基因属单基因编码。     

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析

【目的】黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 雌激素相关受体（estrogen-related receptor, ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR 基因 (BmERR) 的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析, 并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆 BmERR 基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】BmERR 基因全长cDNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示BmERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量 RT-PCR 检测表明,BmERR 在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR cDNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。     

家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究

组织蛋白酶D (cathepsin D,CtD)是溶酶体内天冬氨酸内切蛋白酶,参与机体多种生理病理过程,尤其在昆虫的发育变态过程中起着重要作用。利用NCBI上登录的组织蛋白酶D基因核酸序列和家蚕Bombyx mori表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库,进行电子克隆获得家蚕组织蛋白酶D (BmCtD) 基因的全长cDNA (DQ010007)。该cDNA大小为1 543 bp,其中ORF长1 152 bp,同源性分析表明BmCtD与其他物种的CtD具有较高的相似性。BmCtD的mRNA存在选择性拼接,另外一种mRNA形式命名为BmCtDⅠ。RT-PCR实验表明该基因在本实验所调查的家蚕不同发育时期和组织中都有表达。     

家蚕MYST组蛋白乙酰转移酶基因Bm-mof的克隆表达和转录活性检测

MYST组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)广泛存在于从酵母到人的真核生物中,在真核生物的转录调控中起着重要的作用。利用NCBI已登录的其他物种该基因的氨基酸序列与家蚕的基因组框架图和表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库进行电子克隆,获得了家蚕中的同源基因。该基因长1 575 bp（GenBank登录号为DQ442997）,开放阅读框(ORF)长1 326 bp,无内含子。基因编码442个氨基酸,预测蛋白质的分子量为51.4 kD。序列中有HAT核心结构域、锌指结构域和染色质域3个保守的结构域,与其他物种同源基因具有较高的序列相似性。RT-PCR结果表明该基因在本实验所检测的家蚕各时期和组织中均有表达。将该基因用亚克隆的方法导入到pET50b载体中并成功地进行了原核表达,表达出了带有6个组氨酸和1个Nus·Tag标签的重组蛋白。     

家蚕羧酸酯酶基因Bmae35的克隆、 序列分析及表达

昆虫羧酸酯酶是一类能对外源化合物解毒和气味分子降解的重要酶系。本研究选取在家蚕Bombyx mori幼虫嗅觉感器中有表达, 并与蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides触角酯酶基因Snon-EST可能为直系同源基因的Bmae35进行克隆和外源表达研究。结果表明： 该基因编码区长1 581 bp, 共编码526个氨基酸。与其他昆虫触角酯酶的多序列比对分析发现, Bmae35编码的蛋白具有酯酶活性必须的催化残基Ser191, Glu313和His429, 也保持着α-酯酶家族特征基序Gly-x-Ser-x-Gly。RT-PCR分析显示, Bmae35在家蚕5龄第3天各组织中均有表达, 其中在头、 脂肪体、 马氏管、 体壁和丝腺中的表达量较高。Bmae35在雌蛾性信息腺中表达, 并与性信息素合成呈正相关, 暗示其在信息素合成中起重要作用。构建Bmae35与pET28(a) 重组载体, 经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,电泳检测发现该基因以包涵体形式表达, 以镍亲和层析柱纯化, Western blotting鉴定证实Bmae35在大肠杆菌Escherichia coli中正确表达并得以纯化。本实验通过对家蚕Bmae35基因的克隆、 原核表达与纯化, 为进一步深入研究其表达定位和气味降解等功能奠定基础。     

家蚕CyPA基因的克隆、表达谱及进化分析

CyP蛋白家族在蛋白质折叠过程中起着重要作用。本研究克隆了家蚕Bombyx mori CyPA基因(BmCyPA),该基因由2个外显子和1个内含子组成,推导开放阅读框编码165个氨基酸,分子量为19.4 kD,等电点为8.79。序列分析表明BmCyPA在不同物种间具有高度的保守性,含有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性位点及与CsA侧链结合的氨基酸,提示BmCyPA可能具有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性和与CsA结合的特性。组织表达谱及EST数据分析显示,BmCyPA在丝腺中高丰度表达。通过对不同物种来源的CyP基因的进化分析,进一步预测了BmCyP基因的功能,BmCyP可能与丝蛋白的正确折叠相关。     

不同催青方式对二化性家蚕过氧化氢酶基因表达的影响

25℃明催青和15℃暗催青分别诱导二化性家蚕Bombyx mori 产滞育性卵和非滞育性卵。此前我们的研究表明, 上述催青处理的二化性家蚕H₂O₂水平存在显著差异。过氧化氢酶（catalase, CAT）是昆虫清除H₂O₂的关键酶。为了进一步明确家蚕滞育过程中H₂O₂代谢的调控机制, 用RT-PCR测定了上述两种催青处理对二化性家蚕CAT基因表达的影响。结果表明：25℃明催青显著提高了滞育诱导和决定阶段的CAT mRNA 水平和CAT活性。滞育性卵的CAT mRNA水平在产后24 h形成峰值, 在72 h后消失; CAT活性在96 h前上升, 120 h后保持于低水平。非滞育性卵的CAT mRNA水平和CAT活性都随着胚胎发育而上升。可见, 25℃明催青诱导二化性家蚕子代滞育可能是通过影响CAT基因表达来调节H₂O₂水平。     

家蚕丝素蛋白轻链基因（fib-L）启动子序列的克隆及其活性分析

家蚕Bombyx mori丝素蛋白轻链（fibroin light-chain, fib-L）基因fib-L具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为了利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工厂,本实验对fib-L启动子活性进行了研究。通过PCR法克隆了fib-L启动子元件,序列分析显示fib-L启动子由位于-33 ～ -25处的TATA盒元件和位于－128～－121处的特征性序列GTCAATTT共同组成。用fib-L启动子控制报告基因DsRed进行家蚕BmN细胞和蚕体内的瞬时表达研究,结果表明fib-L启动子可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

家蚕BmChd64基因的克隆与表达定位分析

Chd64是含有钙结合蛋白同源（Calponin homology,CH）结构域的蛋白,在果蝇蜕皮激素与保幼激素信号通路中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为研究对象,利用PCR克隆了与果蝇Drosophila melanogaster DmChd64同源的BmChd64基因,与表达载体pET-28a连接后,成功获得体外原核表达的BmChd64蛋白,并对其进行了亚细胞定位分析。家蚕BmChd64基因开放阅读框（ORF）的序列为567 bp,编码188个氨基酸,预测分子量大小为20.9 kDa,理论等电点为8.41,编码的蛋白在第27~130个氨基酸处存在CH结构域。同源性比对与进化分析显示,BmChd64与赤拟谷盗Tribolium castaneum和果蝇的Chd亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,BmChd64在家蚕5龄游走期的不同组织中均有表达,且在翅原基中的表达趋势与家蚕体内蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）滴度变化规律一致。亚细胞定位结果显示,BmChd64在细胞核与细胞质中均有分布,细胞核内荧光信号较强,且在细胞核外围较弱,推测细胞质中BmChd64也可入核,最终定位在细胞核中。研究结果表明BmChd64可能主要通过20E信号通路调控翅原基等的变态发育,这为进一步完善20E调控昆虫变态发育的分子机制提供了实验基础。     

家蚕BmBrat基因的克隆与鉴定

NHL家族蛋白具有调控细胞增殖与分化的功能,在哺育动物中被广泛研究。本文克隆得到家蚕NHL蛋白家族成员BmBrat基因,通过RACE技术获得该基因cDNA全长序列为3 614 bp,其ORF为2 580 bp,编码859个氨基酸,预测其蛋白分子量为94.3 kDa,等电点为6.65。利用RT-PCR技术检测其在五龄3 d家蚕各组织表达情况,结果表明其在幼虫各组织均有表达,包括丝腺、中肠、脂肪体、马氏管等,且卵巢和头部表达量最高;胚胎时期表达谱分析显示其在胚胎发育第4天和第5天有高量表达。经原核表达、蛋白纯化及免疫小鼠后获得家蚕BmBrat多克隆抗体,且Western blotting及免疫荧光检测显示该抗体可以特异检测家蚕BmBrat蛋白;免疫荧光结果表明BmBrat蛋白定位于家蚕血细胞胞质中,为进一步研究BmBrat基因的生物学功能奠定了基础。     

家蚕吡哆醛激酶cDNA的克隆、表达和基因结构分析

吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK, EC2.7.1.35）是维生素B₆关键代谢酶,其cDNA的克隆在昆虫类还未见报道。利用生物信息学原理和使用PCR方法,克隆出编码家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶的cDNA (GenBank登录号DQ452397),体外原核表达成功,并对表达粗提产物进行了酶活检测。克隆到的cDNA含有一894 bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1 kD,含298个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类吡哆醛激酶具有52.84%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶均少10多个氨基酸残基,几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。依据家蚕基因组数据库信息和PLK的cDNA,家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5′端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。