环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,其快速检测具有重要意义.根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,设计一套引物,通过条件优化.成功建立了针对致病性溶藻弧菌的环介导恒温扩增检测技术(loop-mediated isothennal amplification.LAMP).应用LAMP技术,在65℃温育1 h的条件下扩增溶藻弧菌基因组DNA.琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带.该研究建立的LAMP法特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于n(cell)=38/mL的菌液浓度,灵敏度更高.综合分析表明,LAMP技术是快速、简易、实地诊断溶藻弧菌的理想工具.     

乌梅提取物对溶藻弧菌的抑制效应与机理

[背景] 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）能够感染鱼、虾、贝等海洋经济动物,给海水养殖业带来了严重的经济损失,对公众健康及食品安全也构成较大威胁。[目的] 通过研究乌梅（Fructus mume）对溶藻弧菌的抑菌效应及其机理,为乌梅在水产养殖中的进一步开发利用提供理论依据。[方法] 采用试管二倍稀释法测定乌梅提取物（Fructus mume Extract,FME）对溶藻弧菌的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration,MIC）和最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration,MBC）,电导率仪检测溶藻弧菌的相对电导率,分光光度法分析溶藻弧菌的核酸泄露和呼吸链脱氢酶活性及生物膜抑制率,蛋白质电泳检测溶藻弧菌的蛋白质合成情况,扫描电子显微镜观察溶藻弧菌的亚显微结构。[结果] 乌梅提取物对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为1.953 mg/mL和3.906 mg/mL;乌梅提取物显著增加了溶藻弧菌的相对电导率和核酸泄露,明显降低了溶藻弧菌蛋白质的合成能力,对于弧菌的亚显微形态产生了较大影响。同时乌梅提取物显著抑制了溶藻弧菌生物膜的形成和呼吸链脱氢酶的活性。[结论] 乌梅提取物通过增加溶藻弧菌细胞膜通透性及显著抑制生物膜的生成、呼吸链脱氢酶活性及蛋白质的合成,实现抑制及杀灭溶藻弧菌的目的。     

溶藻弧菌溶血活性检测及溶血素基因、启动子区功能

[目的]研究溶藻弧菌的溶血现象,溶血素基因vah的分布及vah基因、vah启动子区对溶藻弧菌溶血活性的贡献.[方法]对46株分离自华南沿海水生动物体内和海水的溶藻弧菌环境株及溶藻弧菌标准株1.1587进行溶血实验;比较具有溶血活性的溶藻弧菌野生株ZJ051、vah基因大肠杆菌BL21重组表达株、vah缺失突变株和基因回补株间溶血能力的差异;检测vah基因在溶藻弧菌中的分布,比较溶血株与非溶血株vah基因及上游启动子区的序列差异.[结果]47.8％的溶藻弧菌菌株产生溶血活性,因此溶血现象普遍存在于溶藻弧菌环境株中;vah基因的表达产物具有溶血活性,vah基因缺失突变株不具有溶血活性,而vah基因回补株恢复溶血活性.vah基因普遍存在于溶藻弧菌中,且基因序列非常相似,氨基酸序列完全相同,然而不同菌株的启动子区第188-190碱基位点存在差异.[结论]溶藻弧菌vah基因是造成溶藻弧菌溶血的直接原因,但溶藻弧菌溶血能力的差异并非是由vah基因本身差异决定,极有可能与启动子区第188-190碱基位点相关.     

溶藻弧菌群体基因组学研究

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种能够对人类以及鱼、虾、贝类等水产品致病的弧菌,给人类健康带来威胁,也给水产养殖业造成巨大的经济损失.目前该物种基于全基因组的遗传多样性和重要遗传元件研究报道较少.本研究对采集自全国4个省份的68株溶藻弧菌进行高通量测序,获得全基因组序列,并结合113株公开发表的...     

溶藻弧菌的毒力相关基因及其对小鼠的致病力

【目的】通过多重PCR检测和小鼠动物实验,对溶藻弧菌环境分离株的毒力因子进行评估,以期获得较强致病菌株和弱致病菌株之间的差别,并初步探讨该菌毒力因子对小鼠的致病机理。【方法】采用多重PCR体系检测毒力相关基因,我妻氏血平板溶血实验和平板酶活实验检测溶藻弧菌株的溶血素和胞外酶;以昆明小白鼠为实验动物,攻毒方式为灌胃和腹腔注射,根据小鼠的致病症状和死亡情况来分析和对比溶藻弧菌的胞外分泌物以及菌体本身的毒性。【结果】10株溶藻弧菌产淀粉酶、卵磷脂酶的比例为100%,脂肪酶、明胶酶次之(为70%),脲酶均未被检出;神奈川现象阳性菌株率为60%。毒力基因检测的结果显示10株溶藻弧菌中toxR、Collagenase、tlh、FlaA、ompW、AspA、fur这些与毒力有关的基因均有分布,而toxS、trh、tdh、UreR并未检出。10株溶藻弧菌中的VA009对小鼠显示了较强的致病性,能造成腹腔积液,经腹腔注射感染此菌后7 d内死亡率高达80%。【结论】不同的溶藻弧菌对小鼠的致病性存在较大差异,溶藻弧菌菌体本身比胞外分泌物对其毒性的贡献要大,而副溶血弧菌的毒性则由其胞外分泌物起主要作用;比较我们筛选出的强致病菌株与弱致病菌株,其上述毒力基因的分布并没有差别,说明溶藻弧菌可能存在一套与副溶血弧菌不同的独立的毒力基因系统。     

溶藻弧菌铁载体合成及外膜蛋白表达的研究

初步研究了海洋动物病原菌溶藻弧菌的铁摄取机制。溶藻弧菌能够在高浓度铁螯合剂2-2二联吡啶的培养基中存活。在限铁环境中,溶藻弧菌生长受到抑制,补加铁可以消除这种抑制作用。通过铁载体定量检测,发现分离于发病鱼体的溶藻弧菌MVP01产铁载体量大于分离于海水的菌株No·1·1587。互补实验证明溶藻弧菌的铁载体粗提物能够被铁载体合成缺陷的大肠杆菌突变株AN93利用。在铁限制培养环境中,溶藻弧菌合成了约80kD铁调控外膜蛋白。铁摄取系统在溶藻弧菌的生存和致病性方面,都有重要的作用。     

研究报告: 基于核酸适配体的胶体金比色法检测鳗弧菌

目的 鳗弧菌（Vibrio anguillarum）可引起鲑鱼、鳗鲡、鲈鱼和牙鲆等多种水产养殖动物的疾病，是水产养殖中的一种重要病原菌，对其进行快速检测是确保水产养殖安全和食品安全所必需的。方法 本文利用鳗弧菌与其核酸适配体之间较强的亲和力，通过鳗弧菌夺取胶体金颗粒表面的核酸适配体，使胶体金溶液的吸光度发生变化，从而建立一种可定量检测鳗弧菌的方法。结果 该方法对鳗弧菌的吸光度值显著高于对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌等非目标菌的吸光度值（P<0.01），并在1~10⁵ CFU/ml的检测范围内呈现较好的线性关系。用该方法对不同盐度和鱼体组织样品进行加标回收检测，结果显示回收率和相对标准偏差等指标都符合相应检测标准。结论 该检测方法对鳗弧菌有较好的特异性，可用于水产品或食品中鳗弧菌的定量检测。     

江苏省水产品中溶藻弧菌分布情况

随机采集江苏省各地区的超市和农贸市场鲜活水产样品252份,参考国家标准中副溶血性弧菌的检验方法,采用形态特征观察、生化特性测定并结合特异性基因测定的方法对溶藻弧菌进行分离鉴定。结果显示,252份样品中共有198份分离鉴定出溶藻弧菌,其分离率为79%。其中,淡水产品的检出率为76%,海水产品的检出率为81%。淡水鱼中的溶藻弧菌检出率低于淡水虾贝类产品和海水产品;沿江地区的又高于沿海地区和内陆地区,农贸市场的高于超市。结果表明,海水产品与淡水产品中溶藻弧菌的携带情况非常普遍。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB, 常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种, 弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98%, 相互间不能区分; HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98%以上, 而与所有其它弧菌的相似性不到92%。结合表型和分子特征的鉴定结果, 菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌（Vibrioatginolyticus）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98％,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98％以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92％。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

抗生素对溶藻弧菌SXT/R391元件转移频率的影响北大核心CSCD

【目的】研究萘啶酸、诺氟沙星、卡那霉素3种抗生素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SXT/R391元件ICEVal A056-1转移频率的影响。【方法】利用PCR检测溶藻弧菌A056中ICEVal A056-1的自我剪切、转移潜力。通过溶藻弧菌A056与大肠杆菌菌株VB111的接合实验,研究溶藻弧菌分别在含不同浓度萘啶酸、诺氟沙星、卡那霉素的LB培养基中培养15 min或30 min后,ICEVal A056-1转移频率的变化规律。【结果】溶藻弧菌A056细胞中有环状形式的ICEVal A056-1分子存在,具有水平转移潜力;溶藻弧菌A056在含40μg/m L萘啶酸的LB中培养30 min后,ICEVal A056-1转移频率是对照组的19.59倍;在含50μg/m L诺氟沙星的LB中培养15 min后,ICEVal A056-1转移频率是对照组的31.25倍;在含不同浓度卡那霉素的LB中培养30 min后,ICEVal A056-1转移频率与对照组没有显著差别。【结论】部分抗生素的使用可以明显促进溶藻弧菌ICEVal A056-1向大肠杆菌的转移,因此海洋环境中抗生素的滥用及随意排放很可能加剧ICEs(integrating conjugative elements)从溶藻弧菌到其他细菌的传播。     

一株宽谱裂解性溶藻弧菌噬菌体ФV170的分离鉴定及生物学特性

【背景】溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中重要的条件致病菌,对海水养殖业造成了极大的危害。传统的抗生素疗法引发的耐药问题已经成为全球面临的严峻挑战之一,而作为可替代抗生素的噬菌体疗法已被证实能够有效治疗弧菌病。【目的】深入研究溶藻弧菌噬菌体ФV170的生物学特性,为该菌株在水产动物病害控制中的应用提供数据支持。【方法】以溶藻弧菌V170为宿主菌,采用斑点法从凡纳滨对虾养殖水体中筛选噬菌体,并以双层平板法对噬菌体进行纯化、生长、效价等方面的研究;利用电镜观察噬菌体形态;通过酶切方法分析噬菌体的基因组大小及其类型。【结果】分离得到一株宽谱裂解性噬菌体ФV170,其噬菌斑边缘整齐且通透,12 h直径达1.5 mm。鉴定结果显示,噬菌体ФV170头部为正廿面体的立体对称结构,直径为60 nm-65 nm,尾部长为65 nm-75 nm,宽14 nm-18 nm,核酸类型为dsDNA,基因组大小约为45 kb,对氯仿不敏感,属于有尾噬菌体目(Caudovirales)肌尾噬菌体科(Myoviridae)。此外,噬菌体ФV170可裂解15株溶藻弧菌中的7株,属于种内宽谱;最佳感染复数为0.01;一步生长曲线显示潜伏期为10 min,裂解量为101.3;对65°C以上温度敏感。【结论】分离得到一株宽谱裂解性溶藻弧菌噬菌体,该噬菌体具有治疗海水养殖过程中溶藻弧菌病的潜力。     

溶藻弧菌中类霍乱弧菌毒力岛转座酶基因及侧翼序列分子生物学特征分析

[目的]调查类似霍乱弧菌毒力岛(VPI)转座酶(vpiT)的基因是否在溶藻弧菌中分布,并了解其全序列及侧翼序列的分子生物学特征.[方法]对94株溶藻弧菌是否携带类似VPI的vpiT基因进行PCR检测,对阳性株进行了PCR产物直接测序,根据获得的部分已知序列,设计引物,通过反向PCR扩增出全长类似vpiT的基因valT及部分侧翼片段,对反向PCR产物进行克隆测序,然后对获得的valT及侧翼序列进行生物信息学分析.[结果]发现94株溶藻弧菌中只有从粤东对虾池水分离的2个株E06011、E0612在PCR检测中产生了预期扩增片段.测序表明两者序列(valT-S1)完全一致.根据反向PCR及克隆最终获得的溶藻弧菌E0601全长valT基因及部分侧翼序列valT-S3.对valT-S3生物信息学分析表明:valT是一个高度类似于霍乱弧菌毒力岛vpiT的转座酶基因.[结论]根据上述结果及相关文献,有理由相信valT基因及其侧翼片段是异源获得,霍乱弧菌VPI元件或整体很可能在包括溶藻弧菌在内的弧菌种间转移.     

基于纳米金核酸探针的新型试纸条对灿烂弧菌快速检测

灿烂弧菌Vibrio splendidus作为一种水产条件致病菌,可以感染多种水产养殖动物,给水产养殖业带来巨大的经济损失。文中将核酸外切酶Ⅲ酶切信号放大策略和纳米金标记DNA探针核酸试纸条相结合,建立了一种新型高效的灿烂弧菌检测方法,检测结果可凭肉眼直接判定,并突破了常规免疫试纸条单克隆抗体制备困难的障碍。经过实验条件优化,该核酸试纸条对灿烂弧菌人工合成寡核苷酸DNA片段的检测限是5 ng/mL,对灿烂弧菌基因组DNA实际样本的检测限是10 ng/mL,较PCR法灵敏度高,并对灿烂弧菌具有检测特异性。研究结果实现了核酸试纸条的快捷制备及对灿烂弧菌的高效检测,为水产病害的防治开辟了新的途径。     

鲑点石斑鱼皮肤抗菌活性蛋白的纯化及抗菌活性(英文）

近年来在多种生物体中都发现有抗菌活性蛋白和多肽。由于其具有生物化学多样性,抗病毒、微生物、真菌、原生动物、肿瘤,促进伤口愈合等生物学活性,而引起研究者的极大兴趣。抗菌活性蛋白和多肽在动物的先天免疫中具有重要作用,它们直接作用于细菌,并将其杀死。鲑点石斑鱼(Epinephelusfario)是中国南方水产养殖中重要的海水鱼。近年来,由于细菌和病毒引发的病害造成鲑点石斑鱼大量死亡,但其抗菌活性蛋白及多肽目前还未见报道。本研究发现鲑点石斑鱼皮肤具有抗菌活性成分,鲑点石斑鱼皮肤匀浆物经胰蛋白酶水解后抗菌活性丧失,说明该活性是由蛋白质引起的。经离子交换层析及凝胶过滤层析,从鲑点石斑鱼皮肤中分离纯化到抗菌活性蛋白(Efap)。SDS-PAGE显示,Efap为单链蛋白,分子量约41kD。该成分能同时抑制革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、滕黄微球菌、枯草牙胞杆菌和革兰氏阴性菌,如溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。革兰氏阴性菌中,溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和多杀性巴氏杆菌对Efap较敏感,MIC<20mol/L,其他3种菌敏感性较差,MIC>20mol/L。另外,Efap显示出较强的抗金黄色葡萄球菌的活性,MIC为5—10mol/L。Efap的广谱抗菌性,说明其在鲑点石斑鱼免疫防御中具有一定的作用。     

大黄鱼源溶藻弧菌的鉴定及其菌蜕制备

【背景】菌蜕是诱导Phi X174噬菌体裂解基因E(Lysis E)在革兰氏阴性菌中表达后所获得无细胞内容物的细菌空壳。菌蜕生物安全性高,能以类似活菌方式诱导机体产生良好的系统和黏膜免疫应答。【目的】对分离自患溃疡病大黄鱼肝脏中的病原菌株16-3进行种属鉴定,利用温控调节表达系统控制Phi X174噬菌体裂解基因E在该菌株中的表达来制备菌蜕,为防控鱼类溶藻弧菌感染提供有效手段。【方法】采用形态特征观察、生理生化特性测定及16S r RNA基因序列分析等方法对菌株16-3进行鉴定;构建温控裂解质粒p BV220-Lysis E,并将其电转至溶藻弧菌菌株16-3,形成重组溶藻弧菌菌株16-3(p BV220-Lysis E);将不同起始浓度的重组溶藻弧菌培养物同时进行42°C升温诱导,比较其溶菌动力曲线和裂解效率的差异;在最佳条件下制备溶藻弧菌菌株16-3菌蜕,电镜观察其形态与结构,采用倾注平板法测定冻干菌蜕中的活菌数。【结果】综合菌株16-3在形态、生理生化及16S r RNA基因系统发育等方面的特性,确定其为溶藻弧菌;构建了温控裂解质粒p BV220-Lysis E和重组溶藻弧菌菌株16-3(p BV220-Lysis E);溶藻弧菌菌株16-3菌蜕制备的最佳条件是选择起始浓度OD600为0.3的菌液进行诱导,诱导3 h后即可收获菌蜕,其裂解效率为96.9%,但经冻干处理后的菌蜕无活菌残留;电镜观察发现菌株16-3菌蜕保持原细胞的基本形态,但细胞表面有明显的溶菌孔道,且由于细胞内容流失而使细胞表面发生皱缩。【结论】制备出溶藻弧菌菌株16-3菌蜕,为其作为疫苗或疫苗递送载体奠定了基础。     

溶藻弧菌脓毒症1例

创伤弧菌脓毒症是发生在沿海地区的一种少见而又重要的疾病,具有起病急,病情进展快,死亡率高等特点,已引起人们的关注,但有关溶藻弧菌下肢感染致脓毒症的病例国内外罕见文献报告。2003年10月温州医学院附属第一医院收治临床表现酷似创伤弧菌脓毒症的溶藻弧菌脓毒症患者1例,现报告如下。     

大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选

弧菌是海水养殖环境中常见的条件性致病菌,弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。鉴于水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种（血清型或亚种）弧菌的混合感染,筛选具有潜在的交叉保护性蛋白抗原,作为制备多价疫苗或联合疫苗的侯选成分具有重要意义。文中从患病大黄鱼中分离到8株弧菌,经生理生化和分子生物学鉴定分别为6株哈维氏弧菌Vibrio harveyi,1株溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和1株副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus。选择典型的不同种的弧菌为代表,提取其外膜蛋白,经SDS-PAGE和Westernblotting分析,确定它们大约在45 kDa、35 kDa、22 kDa处出现了3条共同的免疫印迹条带,表明它们很有可能含有共同的能够彼此交叉保护的抗原。利用双向电泳和免疫印迹相结合的方法,借助于MALDI-TOF-MS质谱分析技术,发现溶藻弧菌V.alginolyticus的一种功能未知的孔蛋白（Porin,GenBank Accession No.ZP₀1260407）和副溶血弧菌V.parahaemolyticus的一种麦芽糖孔蛋白的前体蛋白（Maltoporin precursor,GenBank AccessionNo.NP₈01154）能够和哈维氏弧菌V.harveyi全菌多抗产生免疫反应,表明这两种蛋白可以作为3种弧菌的交叉保护性抗原,以此制备的疫苗可望对3种弧菌的感染产生交叉保护作用。     

链霉亲和素-藻胆蛋白的融合表达及其在液相芯片检测中应用

[目的]重组表达制备链霉亲和素-藻胆蛋白融合蛋白,并应用于致病性弧菌液相芯片的检测体系中.[方法]在大肠杆菌中构建链霉亲和素-藻胆蛋白融合蛋白的生物合成途径,通过发酵和亲和层析纯化,制备融合蛋白;设计副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌等四种致病性弧菌特异性检测引物和核苷酸探针,以融合蛋白为荧光标志物,建立四种致病...     

溶藻弧菌耐药基因qnr的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)喹诺酮类耐药基因qnr并分析其蛋白结构,为研究该蛋白的生物学功能奠定基础。[方法]根据NCBI上公布的相关序列设计qnr基因特异性引物,利用PCR方法扩增基因序列,进行DNA测序及生物信息学分析。[结果]从溶藻弧菌染色体上获得qnr基因大小为651 bp,编码216个氨基酸,进化分析可知其与副溶血弧菌有很近的亲缘关系,二级结构分析含有五肽重复序列,三维结构与大肠杆菌质粒上的qnr蛋白空间结构极为相似。[结论]通过对蛋白质序列分析和结构预测,初步确定该基因为喹诺酮耐药基因,为水产细菌的耐药机制研究奠定基础。