鸡血清与卵黄中抗中华眼镜蛇毒IgY动态变化研究

目的探索特异性IgY的产生和变化规律。方法用眼镜蛇毒原毒免疫产蛋母鸡,ELISA定期检测卵黄中的抗体效价变化,小鼠体外中和实验检测其生物活性。第1次免疫40周后,眼镜蛇毒攻击已免疫母鸡,检测攻击前后鸡血清中抗体效价变化情况,未经眼镜蛇毒免疫的母鸡作阴性对照。结果经免疫后第7天蛋黄中即可检测到抗体,经多次加强免疫,40周时蛋黄中还能保持高效价的抗体,通过分离纯化,此抗体可保护实验小鼠免受4 LD50眼镜蛇毒的攻击;同时,鸡血清中也保留着较高效价的抗体,可中和4 LD50以上的眼镜蛇毒。结论用眼镜蛇毒免疫鸡,经多次加强免疫,卵黄和鸡血清中可持久保持高效价的特异性抗体,初步检测此抗体可中和4 LD50的蛇毒。     

抗胱抑素C鸡卵黄IgY抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价、高特异性的抗人胱抑素 C 鸡卵黄 IgY 抗体,并对其基本特性进行分析和鉴定.方法:以人胱抑素 C 为抗免疫产蛋的罗曼鸡,采用水稀释-盐析法提取及纯化 IgY 抗体,采用蛋白质定量、SDS-PAGE、West?ern 印迹和 ELISA 法对 IgY 抗体进行分析和鉴定.结果:免疫后14 d 即可从鸡冠血中检测出抗胱抑素 C 的特异性抗体,抗体效价在28 d 达最高峰(1∶32000),并可维持2个月以上;收集高效价时的免疫鸡蛋,制备鸡卵黄抗体 IgY;还性 SDS-PAGE 显示抗体 IgY 为相对分子质量分别为65×103和21×103的2条带,抗体纯度可达92%,得率为每个鸡蛋36.5 mg,抗体检出敏感度为15.63 ng/mL;Western 印迹证明该抗体具有高度特异性.结论:制备了抗胱抑素 C 的高效价、高特异性 IgY 抗体.     

高效价冻干人用狂犬病疫苗暴露后免疫程序的研究

初步确定高效价冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）暴露后免疫程序。制备高效价的冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）,以狂犬病街毒CNX8601和BD06分别攻击小鼠和比格犬的咬肌,接种不同效价的狂犬病疫苗,以RFFIT法检测中和抗体,根据动物死亡情况,计算暴露后疫苗保护率,对不同效价的疫苗进行中和抗体测定和保护率统计分析。在以小鼠为实验动物的疫苗保护率研究中,冻干人用狂犬病疫苗（3．1IU／剂）0／3／7／14／28免疫程序的保护率为40．6％,高效价的冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）0／3／14免疫程序的保护率为56．2％,中和抗体比较,P〈0．05,2组间有显著性差异;在以比格犬为实验动物的保护效果研究中,冻干人用狂犬病疫苗的保护率（3．1IU／剂）为70％;高效价的冻干人用狂犬病疫苗（6．0IU／剂）的保护率为80％,中和抗体的比较,P〉0．05,没有显著性差异。高效价冻干人用狂犬病疫苗暴露后免疫程序可初步确定为0、3、14d免疫。     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

抗甲型流感鸡卵黄抗体的制备及效价测定

目的:研究抗甲型流感卵黄抗体的制备与纯化,并探讨其效价随免疫时间的变化关系。方法:用灭活甲型流感病毒复合抗原免疫蛋鸡,用PEG6000对卵黄抗体进行分离提取,SDS-PAGE法对其进行分子量测定,考马斯亮蓝法对其含量和纯度进行测定,用微量凝集法检测蛋鸡血清抗体和卵黄抗体的效价。结果:提取得到的卵黄抗体重链分子量为66 kDa、轻链分子量分26 kDa,每毫升卵黄液可得到纯度为95.80%的卵黄抗体9.98mg,回收率93.01%;高效价持续时间90 d以上;免疫蛋鸡血清和卵黄中3种特异性抗体的消长规律基本相似,但抗体水平之间存在明显的差异。结论:采用灭活甲型流感病毒复合抗原免疫蛋鸡可制备高效价、高纯度抗甲型流感卵黄抗体,为卵黄抗体在甲型流感防治中的应用研究奠定了基础。     

高效价猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白多克隆抗体的制备及应用

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)衣壳蛋白(Capsid protein,Cap)是病毒主要的抗原蛋白,在病毒感染和宿主免疫应答中起重要作用。为了制备抗PCV2b Cap蛋白的高效价多克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统对不含核定位信号肽的PCV2b Cap进行了原核表达,获得了可溶性重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清,并进一步以辛酸-硫酸铵沉淀法提纯IgG。ELISA检测显示所制备抗体效价可达到1∶10~7,表明抗体具有较高效价。应用该抗体对人工感染PCV2b的PK-15细胞、小鼠组织进行了免疫印迹、间接免疫荧光和免疫组织化学检测,结果表明该抗体在多种检测方法中均能与目的抗原发生特异性结合。该研究制备的高效价抗体为PCV2b的临床检测及科学研究提供了候选工具。     

南方红豆杉的苯丙基转移酶异源表达和抗体制备

构建了紫杉醇生物合成途径中连接紫杉醇主链bac Ⅲ与侧链C-13 O的苯丙基转移酶原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了这种蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,获得了高效价(1:102400)抗体.免疫印迹检测表明,制备的抗体具有较高的特异性.     

胰岛素受体抗体的产生及其初步鉴定

六年前Kahn等报道了在严重抗胰岛素型的特殊的糖尿病患者(称B型)的血清中,存在有胰岛素受体的抗体。这种抗体可以抑制胰岛素与其受体的结合,并且有类似胰岛素的生物活性,如促进葡萄糖的氧化、抑制脂肪的分解等。这一发现,对于糖尿病的临床和胰岛素受体的研究都是很重要的。从那以后,人们尝试通过免疫动物的方法获得胰岛素受体的抗体。但迄今,无论是用含胰岛素受体的细胞膜或用纯化的胰岛素受体免疫动物,所获得的胰岛素受体的抗体,都只能模仿胰岛素的生物活性,而不能象从糖尿病患者(B型)中获得的胰岛素受体的抗体那样抑制胰岛素与其受体的结合。人胎盘细胞膜含有比胰岛素典型靶细胞更丰富的胰岛素受体。本文用人胎盘细胞膜免疫家兔获得了人胎盘细胞膜蛋白的抗体,并对其中的胰岛素受体的抗体进行了初步鉴定。     

DNA免疫制备单克隆抗体的研究进展

ＤＮＡ免疫是近年发展起来的一种新型抗体制备法。ＤＮＡ免疫克服了传统蛋白质免疫方法的缺陷,能更为有效地激发机体的体液和细胞免疫应答。尤其是在仅知ＤＮＡ编码而不能获得目的蛋白或获得的抗原蛋白为低免疫性的情况下,蛋白质免疫将很难得到特异性的抗体。但通过ＤＮＡ免疫可制备高效价特异性的抗体,这为某些疾病如病毒性疾病和肿瘤等的诊断和免疫治疗开拓了新的途径。     

高效价兔抗小鼠IgG抗血清制备

在免疫学技术中,如放射免疫,免疫酶标技术,免疫荧光等方法常用标记的第二抗体来检测小鼠抗原特异性抗体,包括单克隆抗体的产生。如何获得高效价的兔抗小鼠抗血清,是一个重要的技术问题。经常遇到的一个问题就是所获抗血清的效价常不够理想。我们在     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

本文旨在制备小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglo binbinding protein,mUGBP)多克隆抗体,为后续研究工作奠定基础。通过生物信息学分析方法预测mUGBP蛋白的跨膜结构、理化特性、疏水性等因素,设计出两段多肽,分别与匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)交联后免疫新西兰兔,结果显示其中一个含13个氨基酸残基的多肽序列(221st～233rd)可用作抗原免疫动物,并成功获得高效价的抗mUGBP多克隆抗体。通过ELISA法检测其效价为1:108,亲和层析纯化后Westernblot检测抗体特异性,并将制备的抗体应用于免疫印迹及人和小鼠肺组织免疫组织化学和免疫荧光检测,结果显示本研究制备的抗体具有特异性,且用该抗体成功在人和小鼠气道上皮细胞和肺血管内皮细胞检测到UGBP蛋白表达。结果表明,本研究通过生物信息学方法成功预测了抗原表位,并据此预测成功制备了高效价、高特异性的抗mUGBP多克隆抗体。     

β-TC3细胞膜与胰岛素受体结合G蛋白的鉴定

目的:用免疫共沉淀的方法检测β-TC3(小鼠胰岛β细胞瘤细胞)细胞膜中与胰岛素受体结合的G蛋白.方法:提取β-TC3细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀及蛋白质印迹的方法,检测G蛋白α及β亚基的表达.结果:抗胰岛素受体抗体沉淀胰岛素受体结合的G蛋白复合物后,分别用抗胰岛素受体抗体、抗G蛋白α亚基抗体及抗G蛋白β亚基抗体,检测到胰岛素受体、G蛋白α亚基及G蛋白β亚基的表达.结论:在β-TC3细胞膜中,胰岛素受体与G蛋白共存,G蛋白α亚基及β亚基与胰岛素受体可能存在直接的相互作用.     

多胺调节因子-1原核表达与多克隆抗体制备

[目的]原核表达和纯化人多胺调节因子-1(PMF-1)并以此为抗原制备多克隆抗体。[方法]PCR扩增人PMF-1编码序列并构建原核表达质粒。将此质粒转化大肠杆菌后,IPTG诱导PMF-1蛋白表达并在变性条件下用NiNTA树脂纯化。将纯化的PMF-1用作抗原免疫大耳白兔以制备抗PMF-1多克隆抗体。ELISA法检测抗体效价,免疫印迹法和细胞免疫化学法分析抗体特异性。[结果]成功构建PMF-1原核表达质粒,在大肠杆菌中IPTG可诱导该质粒高效表达PMF-1蛋白。以纯化的PMF-1蛋白为抗原免疫大耳白兔后,获得高效价的抗PMF-1抗血清(抗体效价为1∶128 000)。该抗体能与PMF-1蛋白特异性结合,并可用于PMF-1的免疫印迹和细胞免疫化学分析。[结论]成功建立了人PMF-1原核表达和纯化技术,并制备出高特异性的抗PMF-1多克隆抗体,该抗体可用于PMF-1的免疫印迹分析和细胞免疫化学分析。     

JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体的制备

目的制备pET-32a(+)-VP1蛋白的多克隆抗体。方法用纯化后的VP1蛋白分4次免疫兔子,颈动脉插管法取血,制得多克隆抗体。结果用ELISA法和Western blot鉴定多克隆抗体的效价得1?320000。该抗体可以用Western blot法检测出59 kD左右的VP1蛋白。结论成功制备高效价的JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体。     

重组人骨形态发生蛋白-2抗体的制备及纯化

骨形态发生蛋白-2是骨科研究领域的重要生物蛋白。用重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP₂)与BSA连接成复合物作为免疫原,免疫家兔制备出多克隆抗血清。分别用免疫沉淀法和Sepharose4B-BSA反向免疫亲和吸附法去除抗血清中载体BSA抗体。用盐析法和蛋白层析法纯化出抗rhBMP₂抗体。研究发现,家兔产生高效价抗体的最佳时间为14-16周,从rhBMP₂抗体的特异性、相对纯度及回收率综合分析,免疫沉淀法去除BSA抗体优于反相亲和吸附法。     

几种海洋红藻中的R—藻红蛋白对胰鸟素抗体的免疫反…

本文利用点免疫结合测定法研究了条斑紫菜,红毛菜,多管藻,海萝和江蓠中两种不同分子量的Ｒ－和ｒ－藻红蛋白（ＰＥ）对胰岛素抗体的免疫反应性。这５种红藻中的Ｒ－藻红蛋白都可用蔗糖密度线性梯度超速离心法,得到分子量不同的两种Ｒ－ＰＥ。它们与胰岛素抗体都发生免疫结合反应,但用反射扫描色谱测定,在抗原量相同的比较实验中,反映它们免疫结合反应的棕色斑点的扫描峰面积有所不同。即它们与胰岛素抗体的结合率不同,其中海     

ET抗体对葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征的免疫保护作用

目的探讨ET抗体对葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征的免疫保护作用。方法用重组ETA和ETB建立检测血清ETA和ETB抗体的间接ELISA法,用建立的ELISA法测定商业化人高效价丙种球蛋白（IVlg）、葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征（SSSS）患儿、特应性皮炎（AD）患儿和健康儿童血清中ETA和ETB抗体的效价。用重组ETA和ETB皮下注射新生小鼠建立SSSS动物模型,在注射重组ETA和ETB的同时和3h后在小鼠腹腔内注射ETA和ETB抗体,观察小鼠发病情况和皮肤组织病理改变。结果IVlg中测出高效价的ETA和ETB抗体;SSSS患儿、AD患儿和健康儿童血清中ETB抗体效价（A450nm）分别为0．863±0．276、1．027±0．222、0．990±0．151。SSSS患儿血清中ETB抗体效价明显低于AD患儿和健康儿童,差异有统计学意义（P〈0．05）,但三者问ETA抗体的效价差异无统计学意义（P〉0．05）。注射ETA和ETB抗体的新生小鼠发病、皮肤组织病理改变和死亡率均低于仅注射重组ETA和ETB小鼠。结论ET抗体对葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征具有免疫保护作用,以ETB抗体为主,可减轻皮肤损伤,降低死亡率。     

抗HIV-1 p15(gag)IgY抗体的制备及活性检测

目的:制备具有高效价强特异性的抗HIV-1 p15(gag)鸡卵黄抗体(IgY),纯化并分析其免疫学活性。方法:用纯化的HIV-1 p15(gag)蛋白抗原免疫蛋鸡,用水稀释法对IgY抗体进行粗提取并结合乙醇沉淀和氯化钠盐析法纯化抗体,再通过SDS-PAGE、Western blot、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体的纯度、特异性及效价。结果:表达纯化的HIV-1 p15(gag)-GST融合蛋白分子量为45kDa,用于抗体检测的抗原。用纯化的His-P15蛋白作为免疫原免疫蛋鸡后,获得的卵黄抗体重链、轻链分子量分别为65kDa和25kDa。8倍体积水稀释卵黄,pH值5.1,20%冰乙醇及0.028mol/L盐溶液分离纯化,纯度可达96℅,每毫升卵黄液可得到的卵黄抗体为9.8mg。终浓度为18%～25%的冰乙醇纯化的抗体浓度高且稳定,同时具有较强的特异性和较高的效价。结论:用HIV-1p15(gag)蛋白免疫蛋鸡,可以获得高效价的特异性抗体IgY,为IgY抗体在HIV-1p15蛋白的研究奠定了实验基础。     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体。方法利用RT—PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a（＋）质粒,构建原核表达载体pET-28a（＋）-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta（DE3）pLacI诱导其表达。使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性。结果克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体。结论成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价。为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。     

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败.抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体.但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化.重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法.对当前的纯化方法进行了一个简要的综述.