口蹄疫病毒多基因重组质粒在BHK-21细胞中的表达

利用定点突变的原理,获得包含有口蹄疫病毒P1,2A,3C及部分2B编码区的目的基因片段,KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1（+）,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,将重组质粒pcDNA3.1/P12X3C转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。     

登革2型病毒衣壳蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

从构建的重组质粒pLEX—C中高保真PCR获得编码登革2型病毒43株C基／E／（D2C）DNA片段,通过基因重组的方法将其克隆入真核表达载体pcDNA6／V5-His获得了重组真核表达载体pc／D2C。经电穿孔的方法转染BHK21细胞后,分别通过RT—PCR、免疫荧光和western印迹鉴定表达的蛋白。结果重组蛋白在BHK21细胞中获得表达,表达的蛋自主要存在于胞浆中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异识别。此研究为深入了解登革病毒衣壳蛋白在病毒复制及组装过程中的生物学功能奠定了基础。     

牛α-IFN及FMDV P12A3C双表达载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

从口蹄疫病毒Asia I/Jiangsu毒株的细胞毒中提取总RNA,通过RT-PCR方法分别获得FMDV的P12A及3C基因;同时以pMD18-T-α-IFN质粒为模板,PCR扩增得到α-IFN基因.将α-IFN基因及FMDV P12A及3C基因连接至双启动子表达载体pBudCE4.1上,构建成双效表达质粒pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C,经电泳、PCR、双酶切和DNA测序鉴定表明双效质粒载体构建成功.用此重组质粒转染BHK-21细胞后并对其表达情况进行检测,表明该双表达质粒在BHK-21细胞中能够成功表达.以此重组质粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50/O.1 mL的量进行攻毒,结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖,对乳鼠有一定的保护作用.结果表明成功构建了牛α-IFN及FMDV P12A3C组合基因双表达载体,为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础.     

共表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因牛肾细胞株的筛选及稳定性

[目的]筛选稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的牛肾细胞(Madin-Darby bovinekidney,MDBK)株.[方法]采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法从重组质粒pMD-P1-2A和pMD-3C中分别扩增口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因,将两基因依次插入逆转录病毒载体pBABE-puro.重组逆转录病毒载体pBABE-puro/P1-2A-3C和pVSV-G质粒载体用脂质体介导共转染GP2-293包装细胞.产生的重组逆转录病毒感染MDBK细胞后使用嘌呤霉素筛选抗性细胞.利用克隆环套取法得到单克隆细胞.经间接免疫荧光和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)方法检测MDBK细胞中衣壳蛋白的表达,并在电镜下观察口蹄疫病毒空衣壳.[结果]成功筛选到稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的MDBK细胞株,衣壳前体蛋白P1-2A在蛋白酶3C裂解作用下正确组装成空衣壳.[结论]该研究为口蹄疫亚单位疫苗的研制提供了实验材料.     

登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用

根据登革 2型病毒衣壳蛋白C基因和葡萄球菌核酸酶SN基因序列设计引物 ,从构建的原核表达载体pLEX D2C SN中扩增获得编码登革病毒衣壳蛋白和葡萄球菌核酸酶的融合基因D2C SN ,将其插入到真核表达载体pcDNA6 V5 His中 ,筛选获得重组质粒pcDNA D2C SN .电穿孔转染BHK细胞后 ,5mg Lblasticidin压力筛选 ,通过RT PCR、间接免疫荧光和免疫印迹鉴定表达的蛋白 ,体外DNA消化试验检测核酸酶活性 .结果表明 ,融合蛋白D2C SN在BHK细胞中获得了稳定表达 ,表达的融合蛋白能够被抗登革病毒衣壳蛋白的单克隆抗体特异识别 ,并具有良好的核酸酶活性 ,能够对DNA进行切割 .同时 ,BHK细胞中稳定表达的融合蛋白D2C SN能够有效抑制登革病毒的增殖 ,使其感染性降低 10 3 ～ 10 4倍 .这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于人类抗登革病毒感染奠定了基础     

含2A片段的重组黄热病毒17D疫苗表达载体的构建

黄热疫苗是一种减毒的黄热病毒17D(YF-17D)活疫苗,是现有疫苗中最安全、最有效的疫苗之一,适于发展为疫苗载体。用RT-PCR法扩增出覆盖YF-17D全长基因组的3个cDNA片段:5′cDNA(A)、3′cDNA(B)和中间cDNA(C),同时引入SP6增强子序列、酶切位点和重复序列。顺序将A和B同E.coli-yeast穿梭质粒pRS424连接,再与C共转染酵母菌,利用缺少色氨酸和尿嘧啶的选择性固体培养基筛选出含YF-17D全长基因组的cDNA质粒。以该质粒为模板,经过DNA重组和酵母同源重组,获得含有口蹄疫病毒蛋白水解酶2A片段的重组YF-17D表达载体。将该表达载体体外转录后,电击转染BHK-21细胞。间接免疫荧光检测结果表明,RNA转录体在BHK-21细胞中进行了稳定的表达;滴度测定与形态学观察结果表明,重组病毒在细胞中的生长曲线等特征同母本YF-17D十分相似。结果提示,利用酵母菌同源重组在2A部位引入异种抗原基因,重组YF-17D表达载体pRS-YF-2A1具有成为高效活疫苗表达载体的潜力。     

口蹄疫病毒P1＋2A基因在BHK-21细胞中的表达

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1＋2A基因的重组表达质粒pQE—Tri／PI＋2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS—PAGE、Western—blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDVPI＋2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别而且具有良好的生物学活性。这一结果的取得,为进一步研制新型口蹄疫基因工疫苗及其配套诊断试剂奠定了基础。     

细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

人类VIM基因的克隆和真核表达载体的构建

目的:构建VIM(Vimentin)基因的真核表达载体,以深入研究VIM的功能及其在相关疾病中的作用.方法:从人cDNA文库中,以RT-PCR方法扩增出1401bp的VIM编码区片段,胶回收后连接入T.载体,测序鉴定.再用Hind Ⅲ和BamHI双酶切,将VIM编码区片段定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定重组质粒.将重组质粒转染NIH3T3细胞,分别以RT-PCR和Western Blot方法检测VIM的mRNA表达和蛋白表达.结果:将人VIM编码区基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中;继而转染NIH3T3细胞后,RT-PCR和Western Blot结果显示细胞可以表达VIM的mRNA和蛋白.结论:成功构建pcDNA3.1-VIM的真核表达载体,为进一步研究VIM基因的功能以及其在相关疾病中的作用奠定了基础.     

The Effect of Bovine IFN-α on the Immune Response in Guinea Pigs Vaccinatedwith DNA Vaccine of Foot-and-Mouth Disease Virus

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) belongs to thegenus Aphthovirus of the family Picornavidae. The FMDVgenome is a copy of positive-sense, single-stranded RNA,which contains one large open reading frame (ORF). TheORF is translated into a polypeptide, which undergoesautoproteolytic cleavage to produce the structural and non-structural proteins and ultimately forms mature viral pro-teins [1,2]. FMD is caused by the FMDV, which is a highly conta-gious vesicular disease of cloven-hoofe…     

编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

miRNA干扰口蹄疫病毒基因组早期复制的初步研究

根据miRNA的设计要求,以miR-31为模型通过软件设计出潜在的能够使3D基因沉默的特异性miRNA序列3D-1203,并以pcDNA3.1(+)质粒为载体构建能够表达成熟miRNA的重组质粒,将其转染到BHK-21细胞后感染口蹄疫病毒,研究3D-1203的miRNA的干扰作用。蚀斑实验结果显示特异性miRNA可以在早期抑制口蹄疫病毒的复制,与阳性对照相比,病毒复制效率降低53.0%。实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测数据表明特异性miRNA干扰病毒基因组增殖的效率达66.7%。本研究证明,利用miR-31设计的特异性miRNA在病毒复制早期能够特异的干扰口蹄疫的复制。