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7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因的启动子活性检测、转录起始点的确定 总被引:1,自引:0,他引:1
分别从重组质粒pUB1及其M(13)亚克隆S1中将7号淀粉酶链霉菌(StreptomycesdiastaticusNo.7)M1033(以下简称S.di.M1033)木糖异构酶基因的-192-+581bp片段克隆入链霉菌启动子探测质粒pIJ4083中,转化变铅青链霉菌(S.lividans)TK24。通过对其邻苯二酚加双氧酶活性的检测表明,该片段具有启动子活性。应用M13亚克隆S1和合成引物P6延伸制备放射性标记的单链DNA探针;通过S.di.M1033的总RNA的S1核酸酶保护实验,确定了其转录的起始位点,并由此探讨了与木糖异构酶基因表达有关的一些因素。 相似文献
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用启动子探针质粒pIJ486从麦迪霉素产生菌(S.mycarofaciens)中克隆到1个具启动功能的HindIII-HindIII2.0kb片段,含该片段的重组质粒p4H2转化子在MM基本培养基上对卡那霉素(Km)抗性可达500μg/ml以上。亚克隆缺失分析结果表明,该片段不同部分的缺失对启动活性有不同程度的影响,说明它具有较复杂的转录调控机制。DNA序列分析结果显示,该片段含有1984个核苷酸,其G+C%为47.7%,不存在典型的链霉菌的可读框;进一步的分析发现,其650bp、1150bp和1500bp区域分别与麦迪霉素酮基还原酶基因等链霉菌基因的启动子序列具有同源性;在520-570bp区域与大肠杆菌tRNA基因上游激活序列(UAS)有较好的同源性,提示链霉菌中可能存在可增强基因转录的DNA元件。 相似文献
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牛疱疹病毒I型前早期基因BICPO的表达对牛免疫缺陷病毒LTR的反式激活… 总被引:2,自引:0,他引:2
由含有BHV-1(Bovine Herpes Virus-1)前早期基因的基因组片段亚克隆ICPO(BHV-1Infected Cell Protein O)的DNA序列至表达载体pSVD3,构建质粒pSV2.9。将该质粒与PBLTR-Luc共转染小牛肺细胞,检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性,BICPO的表达产物可以显著地激活BIV LTR启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据PSV2.9与含有B 相似文献
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日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
研究了外源基因日本血吸虫26kD抗原(Sj26GST)在卡介苗(bacilusCalmete-Guerin,BCG)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和大肠杆菌(E.coli)中的表达.运用重组DNA和聚合酶链反应(PCR)等分子生物学技术,以表达Sj26GST的E.colipGEX衍生质粒为模板,经PCR得到编码Sj26GST的全长cDNA片段.将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70的启动子下游,再将HSP70启动子和Sj26GST基因一起亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,得到E.coli-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26.pBCG-Sj26电转化入BCG和M.smegmatismc2155中表达Sj26GST抗原,所表达的天然重组Sj26GST(rSj26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带.其表达量分别占BCG和M.smegmatis菌体总蛋白的15%和10%.可见,Sj26GST基因能在BCG中高效表达. 相似文献
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以质粒pIJ486为载体,将来源于质粒pHT1的肿瘤坏死坏因子(TNF-a)cDNA克隆至变铅青链霉菌,以新霉素(30μg/ml)为选择标记,获得了数百转化子,实验表明No.7转化子s.lividans TK54-HT所含重组质粒pIJT7已克隆有TNFcDNA。L929细胞毒实验结果表明该转化子TNF表达量可达10^8活性单位/升以上,中和实验确证其表达产物为人TNF-a,SDS-PAGE表明克 相似文献
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中国疫苗株鸡痘病毒插入载体的构建与MDV糖蛋白B的表达 总被引:15,自引:1,他引:15
在对中国鸡痘病毒疫苗株282E4基因组DNA进行克隆与亚克隆的基础上,进一步插入P11-LacZ标记基因,根据蓝斑选择原理筛选出3个病毒在细胞培养物上生长所不必需的片段,为了便于外源基因的插入,特将P7.5-P11-LacZ基因框转移至BLUESCRIPTSKM13-的Apal将MCS-P7.5-P11-LacZ框切下,置入一个亚克隆的非必需片段中,构建成中国鸡痘病毒插入载体pFG1175-1,以 相似文献
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对含有麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶(mpt)基因的BamHI-BamHI8.0kb的DNA片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有21个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因(CarE)的2.4kb DNA片段为探针,经Southern blot分子杂交,将mpt定位于一个EcoRI-EcoRI-PstI3.0kb的DNA片段上,将该片段克隆至大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒载体pWHM3 相似文献
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质粒pSGL1(7.4kb)是从球孢链霉菌(Streptomyces geobisporus)中分离得到的一个高拷贝质粒,已测定其最小复制子序列。从球孢链霉菌总DNA中采用PCR方法扩增获得编码C1027前蛋白信号肽的DNA片断gpp。将gpp克隆至pSGL1的衍生质粒pSGLN中,获得新的链霉菌表达型质粒载体pSGLgpp。应用该质粒进行了人的河溶性白细胞介素1受体I型的表达。 相似文献
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Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因在哺乳动物传代细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有LMP基因(BNLF1)3个外显子(exon)开放阅读框架(ORF)的长1.80kbp的DNA片段,和能分解HygromycinB的含有SV40早期启动子和HgryomycinB磷酸转移酶全基因(长1025bp)的DNA片段(长1.60bp),同时重组于亚克隆载体pBluescriptSK(pBS)中,并使该重组质粒pBS-LMP-Hyg(长5767bp)在乳地鼠肾传代细胞(BHK)中获得表达。BHK细胞在经此重组质粒转染后,LMP阳性细胞是2%,在HygromycinB的持续压力下,LMP表达细胞率可达20%。3个月后,LMP表达细胞逐渐减少。5个月后,不能测到LMP表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹(Westemblot)实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗LMP抗体。 相似文献
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由含有BHBV-1(BovineHerpesVirus-1)前早期基因的基因组片段亚克隆BICPO(BHV-1InfectedCellProteinO)的DNA序列至表达载体pSVK3,构建质粒pSV2.9。将该质粒与pBLTR-Luc共转染小牛肺细胞,检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性,BICPO的表达产物可以显著地激活BIVLTR启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据pSV2.9与含有BIVLTR不同区段缺失的质粒pD-319-Luc、pD-115-Luc、pD-52-Luc共转染小牛肺细胞的实验结果,推测BIVLTR-319位上游区的DNA序列影响BICPO基因产物对BIVLTR表达的激活作用。 相似文献
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酵母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆 总被引:1,自引:0,他引:1
利用以3′-氨基糖苷磷酸转移酶基因(APHI)为报告基因的一套启动子探针质粒pSK-kan401、pSK-kan1105、pSK-kan1238,从酵母Kluyveromycescicerisporus基因组中克隆到8个有较强启动功能的DNA片段,分析出3′端DNA序列,并在酵母Kluyveromyceslactis中通过检测报告基因与3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的mRNA表达量的比值,确定它们的功能强度,其中pSK-kan401-41和pSK-kan1105-51两个克隆的插入片段具有较强的启动子功能,并证明这两个片段在酵母K.cicerisporus中也有启动子功能。 相似文献
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本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。 相似文献
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环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆 总被引:4,自引:0,他引:4
环状芽孢杆菌(Baciluscirculans)C2总DNA经PstI部分酶切后分离2~10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichiacoli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长30kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulansC2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。 相似文献
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小鼠胚胎干细胞系(ES)是从囊胚的内细胞团中建立起来的多潜能胚胎干细胞系。ES细胞系目前正广泛用于将基因打靶后的突变和其它遗传变化导入小鼠的种系中。其中,嵌合鼠的获得是非常必要的一步。这就需要用一个可以广泛表达的基因对ES细胞进行标记。大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-gal)基因的表达在细胞水平就能很容易地观察到,而且对哺乳动物细胞没有任何毒害作用,因而是一个被广泛地用于各种细胞基因表达研究中的报导基因。猿类巨细胞病毒早期(SiCMVIE)启动子是一个广泛用于转基因小鼠研究中的强启动子。然而,该启动子在ES细胞方面应用的报道尚未见到。本研究用BamHI和HindⅢ双酶切,从psv-β-galactosidase中得到3.7Kb的lacZ基因片断,将其插入到pINC载体上(Fig.1),得到pINC-lacZ(Fig.2)。用NotⅠ线性化pINC-lacZ后,电击导入MESPU-13细胞中。MESPU-13为本实验室从129/Ter品系小鼠的囊胚中建立的一个ES细胞系。转化细胞在含有250μg/mlG418的培养基上培养两周,进行MESPU-13细胞稳定转化子的筛选。在一次转化实验中,从1x107个转化的MES 相似文献
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CS3纤毛抗原表达调控机理的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
CS3是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素.为了探索CS3菌毛抗原基因的表达调控机制,根据CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的-10区和-35区DNA序列.采用基因重组技术将CS3结构基因上游120bp的DNA片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因lacZ的质粒pCB267中.凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps).将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进pCB267中,报告基因表达结果表明CS3结构基因的表达受其上游区域的抑制.核苷酸序列分析发现,在Ps-35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇.结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用.用CFA/1菌毛抗原基因的正向调节基因cfaD对CS3基因进行的互补表达试验表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力.在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达.同时提出了其表达调控模型. 相似文献
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鉴定了E.coliHB101和JM110的部分遗传标记,作为受体菌分别用于BstNI同功酶限制-修饰系统中限制性内切酶(Restrictionendonuclease,简称R)基因和甲基化酶(Methylase,简称M)基因表达的检测。用外切酶II单向删切含RM基因的DNA片段,获得23个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的R酶和M酶活性,将R和M基因分别定位在距克隆位点PstI的02→14kb和15→3.3kb范围内。分析表明:该系统属于I类限制修饰系统,两个基因受控于不同的启动子;该系统与E.Coli染色体编码的胞嘧啶DNA甲基转移酶(Dcm)的识别序列相同,后者的甲基化作用也能阻止R酶的切割。R+M-的重组质粒对Dcm+和Dcm-的宿主都是致死性的,这说明在进化过程中,与R基因紧密连锁的M基因对系统的存在至关重要 相似文献
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为制备用地高辛精(Digoxigenin,Dig)标记的酶氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase,TH)RNA探针,本研究用分子生物学技术重组质粒PGEMTHI,即分别将携带T7和Sp6启动子的PGEM-3zf质粒和携带TH基因的PKSTH质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带T7和sp6启动子的DNA片段和TH基因片段;经T4DNA连接酶连接后转入大肠杆菌,得到pGEMTH1重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有TH基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状DNA片段,用T7RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链RNA探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。 相似文献
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用pUC19质粒作载体,克隆了黄地老虎颗粒体病毒(Agrolissegetumgranulosisvirus,简称AsGV)DNAPstI-D.E.F.G.H.J.K.等7个片段。以[ ̄(32)P]-dCTP标记的油桐尺蠖核型多角体病毒(Buzurasuppressarianuclcarpolyhedrosisvirus简称BsNPV)多角体蛋白基因为探针,在37℃条件下对AsGV)颗粒体蛋白基因进行了定位,将其分别定位于BslⅡ-S或TPsTI-A或B和EciRI-A片段上。 相似文献