嗜盐细菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生物合成及其生物学功能

在嗜盐细菌盐适应中,四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)和羟基四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)发挥着十分重要的作用.四氢嘧啶的生物合成以L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)为底物,依次由2,4.二氨基丁酸转氨酶(EctB),2,4--氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)和四...     

四氢嘧啶羟化酶的研究进展

作为相容性物质,5-羟化四氢嘧啶不仅可以调节渗透压,还可以稳定蛋白结构,在医药、生物制造和化工行业具有广阔的发展前景。四氢嘧啶羟化酶属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族,主要催化四氢嘧啶生成5-羟化四氢嘧啶。我们简要介绍了四氢嘧啶羟化酶的基因来源、活性检测、蛋白结构、催化机理及活性中心等方面的研究进展。     

紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究

来源于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的苯丙氨酸羟化酶结构简单,性质更接近于人的苯丙氨酸羟化酶,具有潜在的医药应用价值。从紫色色杆菌基因组中克隆得到苯丙氨酸羟化酶基因pah。构建重组表达载体pET24a-pah,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现高效表达。离子层析纯化后,重组蛋白比酶活高达503.2 U/mg。酶学性质研究显示,该重组酶的最适温度为40℃左右,50℃时PAH的半衰期为15 min;最适pH在7.5左右,在pH6-8范围内较稳定。37℃,pH7.5条件下,Km值为1.5 mmol/L,Vmax为0.5 mmol/min,kcat为5.05/s,催化效率kcat/Km为3.37 L/mmol·s。     

相容性溶质四氢嘧啶及其羟基化衍生物的研究进展

四氢嘧啶类化合物是嗜盐以及耐盐菌胞内合成的一类能够抵御外界高盐胁迫的相容性溶质,概述了四氢嘧啶及其衍生物的理化特征以及在嗜盐微生物中抵御外界高渗透压的作用机理,主要阐述了四氢嘧啶类相容性溶质的生物合成途径、膜运输机理、分泌释放机制、高密度发酵生产等方面在细胞、分子水平上的最新研究进展以及前景展望。并且综述了四氢嘧啶类在精细化工、生物医药及生物制造等行业的应用研究以及发展前景,探讨了未来的研究方向。     

苏云金芽孢杆菌重组L-异亮氨酸羟化酶的酶学性质及其在4-羟基异亮氨酸合成中的应用

【目的】克隆并表达来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TCCC 11826的L-异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine-4-hydroxylase,IDO),测定重组IDO酶学特性并构建用于4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine,4-HIL)微生物转化的重组菌株,以考察该酶在4-HIL合成中的潜在应用价值。【方法】以B.thuringiensis TCCC 11826基因组为模板PCR扩增ido基因并构建该基因过表达菌株BL-IDO;采用Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组IDO后检测其酶学特性;构建重组株菌W3110-IDO进行4-HIL的微生物转化。【结果】克隆B.thuringiensis TCCC 11826的ido基因,测序结果显示该基因含723个核苷酸,编码240个氨基酸,与已报道的B.thuringiensis 2-e-2的ido基因相似度分别为97.47%和97.91%。此IDO含有His1-X-Asp/Glu-Xn-His2基序,属于Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族;酶学实验表明该酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成(2S,3R,4S)-4-HIL,其Km和Vm ax分别为0.18 mmol/L和2.10μmol/min/mg,最适反应温度和pH分别为35℃和7.0,该酶于35℃条件下放置5 h后仍具有85.1%的活性;在Escherichia coli W3110中过表达重组IDO,在未经优化条件下4-HIL最高转化率达89.28%。【结论】获得IDO编码基因序列(Accession No.KC884243)并首次较为系统地研究了其酶学特性,该酶反应条件温和且具有较高的活性及稳定性,在酶法或微生物转化法合成4-HIL中有较广泛的应用价值。本研究可为4-HIL及其它氨基酸衍生物的生物制造技术奠定理论基础。     

盐单胞菌属BYS1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达

利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,预测编码的DAT(L-二氨基丁酸转氨酶)、DAA(L-二氨基丁酸乙酰转移酶)和ES(四氢嘧啶合酶)大小分别为21.1kDa(191 amino acid)、45.7kDa(417 amino acid)和14.5kDa(129 amino acid);将包含ectABC基因及其上游1000bp序列的片段克隆到pUC19中并转化E.coliDH5α,转化子E.coli(pUC19ECT)能够在盐激条件下合成四氢嘧啶,但其耐盐能力没有得到显著改善。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

四氢嘧啶类物质的生物合成与转运途径及其生物学功能

四氢嘧啶类物质是目前发现的在细菌界分布最广泛的相容性溶质,它不仅是一种重要的渗透压调节剂而且也对遭受热变性、干燥、冷冻等不良环境胁迫的嗜盐菌和非嗜盐菌具有很好的保护作用.该文简述四氢嘧啶类物质在生物体内的积累途径及生物学功能方面的研究进展,并对其在农业和生物医学的应用前景进行展望.     

新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中四氢嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及其功能鉴定

研究旨在克隆新的四氢嘧啶合成基因簇,并对其功能进行鉴定,为应用于四氢嘧啶的生产奠定基础。从新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC,ectABC与表达载体pBAD连接后转化至大肠杆菌BW25113中,通过L-阿拉伯糖诱导表达。采用SDS-PAGE和液质联用鉴定重组表达蛋白,利用全细胞催化合成四氢嘧啶,通过高分辨质谱鉴定四氢嘧啶,并从天冬氨酸浓度、KCl浓度、温度和pH 4个方面优化催化条件。结果表明,来自新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2基因组的ectABC大小为2 235 bp。SDS-PAGE显示表达产物中有3个重组蛋白产生,液质联用鉴定表明其分子量分别与ectA、ectB、ectC的理论分子量一致。高分辨质谱分析发现全细胞催化上清中有四氢嘧啶产生。优化后的最适全细胞催化条件为：天冬氨酸浓度100 mmol·L^-1,KCl浓度100 mmol·L^-1,温度30℃,pH 7.0,最优条件下产量为1.11 mg·mL^-1。研究从弧菌中克隆了四氢嘧啶合成基因簇ectABC,并在大肠杆菌BW2511...     

重组GluV8的克隆表达、纯化及酶学性质研究

谷氨酰内切酶在生物制药及检测中应用较多,但来源受限,将全基因合成的金黄色葡萄球菌来源的谷氨酰内切酶功能区部分对应的基因进行改造后,克隆入表达载体pGEX-4T-2,导入E.coli BL21（DE3）,重组蛋白以可溶性形式表达。采用亲和层析等纯化步骤对重组蛋白进行纯化,用底物Z-Phe-Leu-Glu-pNA（L-2135）对重组蛋白的酶学性质进行了研究,用HPLC、LC-MS/MS检测方法对酶切融合蛋白的位点特异性进行了鉴定。结果表明该酶的相对活性为1568U/mg,最适作用温度为42℃、最适作用pH为8.0,在pH 9.0,50℃时仍有较高的酶活,将该酶与胰酶酶切融合蛋白所得肽段结合能够提升质谱检测结果的精确度。以上结果表明该重组酶具有良好的应用前景。     

Cobetia marina CICC10367渗透压冲击下羟基四氢嘧啶的合成及释放

摘要:【目的】筛选获得耐受渗透压冲击的羟基四氢嘧啶合成菌株,利用“细菌挤奶”工艺提高羟基四氢嘧啶的产率。【方法】从盐池中分离羟基四氢嘧啶合成菌株,并对其进行形态、生理生化及16S rDNA鉴定。考察了培养基及其NaCl浓度对羟基四氢嘧啶合成的影响,在优化的条件下利用“细菌挤奶”工艺制备羟基四氢嘧啶。【结果】筛选获得的一株羟基四氢嘧啶合成菌株,鉴定为Cobetia marina CICC10367（C. marina CICC10367）。NaCl浓度为90 g/L的、谷氨酸单钠为唯一碳氮源的培养基有利于羟     

极端耐盐放线菌白色普氏菌YIM 90005T四氢嘧啶及5-羟基四氢嘧啶合成相关基因的克隆

摘要：【目的】 为了研究耐盐放线菌对高盐环境的适应机理。【方法】 用HPLC定量检测了极端耐盐、丝状产孢放线菌——白色普氏菌（Prauserella alba） YIM 90005T在不同盐浓度下胞内相容性溶质的种类和含量。【结果】 结果发现,四氢嘧啶和5-羟基四氢嘧啶是其主要的相容性溶质。在培养基NaCl浓度为10%时,四氢嘧啶在胞内累积浓度最大,为18.77 μg/mg干菌体重。之后随NaCl浓度的升高,胞内的四氢嘧啶含量逐渐减少,而5-羟基四氢嘧啶的含量逐渐增加,在该菌耐受的最高NaCl浓度下（24% w/v）,胞内5-羟基四氢嘧啶含量达到最大值,为22.98 μg/mg干菌体重。设计兼并引物,利用染色体步移,克隆得到四氢嘧啶及5-羟基四氢嘧啶合成相关基因ectABCD。序列分析表明,ectABCD位于一个操纵子中。进一步对不同NaCl浓度培养条件下ectB,D的表达量进行定量分析,结果表明该基因簇表达量随着培养基中NaCl浓度的增加而增大。【结论】 研究结果证实5-羟基四氢嘧啶是P. alba YIM 90005T在极高盐浓度条件下起渗透调节及保护的相容性溶质。     

渗透压冲击下中度嗜盐菌Halomonas sp. Y四氢嘧啶类相容性溶质的合成与释放

【背景】四氢嘧啶类物质在高温、冷冻和干燥等逆境条件下,对酶、蛋白质、核酸及整个细胞具有良好的保护作用,已经应用于酶制剂、生物医药及护肤品等相关领域。目前此类物质只能依赖中度嗜盐菌采用细菌泌乳工艺进行商业化生产,因此四氢嘧啶类高产菌株及其发酵技术的研究日益受到国内外研究者关注。【目的】分离获得高产合成四氢嘧啶类相容性溶质的中度嗜盐细菌,研究渗透压冲击对其胞内四氢嘧啶合成与释放的影响,探索细菌泌乳法制备四氢嘧啶的可行性。【方法】采用涂布平板法分离中度嗜盐菌,对分离菌株进行形态、生理生化和16S rRNA基因序列分析,鉴定其种属;采用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)分析四氢嘧啶类物质,细菌泌乳法制备四氢嘧啶类物质。【结果】从盐池土样中分离到一株以四氢嘧啶类物质为主要相容性溶质的中度嗜盐菌Y,鉴定为盐单胞菌(Halomonas sp.)Y。盐单胞菌Y能在NaCl质量浓度为10-250 g/L的培养基中生长,最适生长的NaCl浓度为100 g/L;HPLC-MS测试结果证明盐单胞菌Y可同时合成四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶2种相容性溶质,在最适生长的盐浓度下其合成量分别达175.5 mg/g和47.9 mg/g;在NaCl质量浓度为0-30 g/L的低渗溶液中胞内四氢嘧啶类物质经5 min即可达到最大释放率,而细菌泌乳工艺中最适合诱导四氢嘧啶释放的低渗溶液为质量浓度为10 g/L的NaCl溶液;采用细菌泌乳工艺制备四氢嘧啶,经连续11轮的高渗/低渗冲击,四氢嘧啶总合成量为6.0 g/L,总释放量为5.7 g/L,平均释放率为64.5%,底物转化率为128.9 mg/g。【结论】盐单胞菌Y是一株较高产合成四氢嘧啶类的中度嗜盐菌,能够耐受反复的渗透压冲击,采用细菌泌乳工艺显著提高了四氢嘧啶的制备效率。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究

丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate format-lyas,PFL）是厌养或兼性厌养微生物中,代谢途径的关键酶之一,为了进一步研究其功能,我们以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增大肠杆菌中的pfl基因,为测序方便将所得DNA片段连接到pMD18-T载体上,将测序正确后的pfl基因连接到表达载体pET-22b(＋)中,重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达, 通过SDS-PAGE电泳分析,在分子量为85kDa处出现新生的蛋白条带。利用金属亲和层析对添加了6×组氨酸标签的PFL进行纯化,对PFL的酶学性质进行了研究。结果表明：此酶的最适温度为35 ℃,最适pH为7.5,米氏常数Km＝2.3mmol,Tm＝49.9℃。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶的晶体制备及X-射线衍射研究

摘要:【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及X-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,289 K下采用座滴法进行晶体筛选和制备,在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku MicroMax-007 HF)收集晶体衍射数据。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了适合晶体生长的蛋白BpEctD。通过筛选最终在蛋白浓度为6.5 mg/mL及含有0.2 mol/L MgCl2·6H2O,0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5,25% (W/V) 聚乙二醇3,350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体,其大小约为360 μm×240μm×60 μm,并在100K下成功收集了衍射数据,晶体衍射分辨率为2.40,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=45.18,b=58.87,c=68.81,α=77.48°,β=86.03°,γ=66.97°,每个不对称单位中含有2 个BpEctD单体,马修斯系数为2.44 3/Da,溶剂含量约为49.53%。【结论】衍射数据的成功收集为假坚强芽孢杆菌OF4四氢嘧啶羟化酶三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明四氢嘧啶羟化酶的催化机制。     

硫色曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆、表达及酶学性质分析

目的:分析硫色曲霉产木聚糖酶的酶学性质。方法:利用RT-PCR克隆了硫色曲霉的木聚糖酶基因xynA,构建了该基因的原核表达载体,并获得了诱导表达。结果:纯化的木聚糖酶的最适催化温度为50℃,最适反应pH值为2.4,在30～50℃保温30min对酶活性没有大的影响。结论:木聚糖酶在低pH值下的催化活性使之在饲料工业中具有较好的应用前景。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶(Nm LEH)通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21 (DE3)宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0. 5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高(0. 45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组Nm LEH蛋白;对Nm LEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH为7. 5,在pH 7. 0～9. 0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明Nm LEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。