微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究进展

甾体激素类药物是临床上不可缺少的一类重要药物。雄甾-4-烯-3,17-二酮是甾体激素类药物不可替代的中间体,对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素类药物都是以其作为起始原料进行生产的。近年来研究表明,通过微生物转化技术,将甾醇边链选择性切除,可得到甾体药物的这一关键中间体.综述了该项技术近期的研究进展,指出该领域工业化生产尚待解决的问题。     

雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)转化菌种的筛选及鉴定

从土壤中筛选能将植物甾醇转化为雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)的菌种。采用富集培养基富集能降解植物甾醇的菌种、采用摇瓶进行发酵、采用薄层层析的方法对发酵产物进行检测、采用高效液相方法测定发酵液中4-AD的含量、采用PCR方法扩增菌种的16S rDNA序列。筛选出了一株转化能力最强的菌株,命名为:3-12。将这株菌的16S rDNA序列与GeneBank中收载的序列进行比对,3-12号菌株为分支杆菌。     

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。     

Mycobacterium sp．高效转化植物甾醇为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的诱变选育

采用紫外线、亚硝基胍复合诱变雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）的转化产生菌Mycobacterium sp．,结合平板筛选,获得一株遗传性状稳定单产ADD的突变菌株Mycobacterium sp．-11,其ADD质量浓度达到1246ms／L,比原始菌株（484mg／L）提高了150％,经初步优化后发酵液中ADD最高达到1430mg／L,发酵液中ADD质量占ADD、AD两产物质量总和的比例由70％提高到99．1％。     

微生物转化雄甾-4-烯-3，17-双酮的菌种筛选和转化条件的初步研究

雄甾-4-烯-3,17-双酮(简称4AD)是甾体药物的重要中间产物,其11α羟化产物可制成治疗心血管疾病的药物。通过对30株不同种属真菌转化4AD能力的筛选,获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)QY2A对4AD有高效C11α羟化能力,得到目标产物C11α-羟基雄甾-3,17-双酮(简称11α-OH-4AD)。另对该菌株的转化条件进行优化,结果表明:初始pH值6.0,温度28℃,转速180r/min,转化时间60h,助溶剂甲醇终浓度和底物浓度分别为2.5%和2.5g/L时,11α-OH-4AD的转化率为65%,比未优化的转化率提高了51.2%。     

Gibberella intermedia C2转化4-雄甾烯-3、17-二酮的研究

甾体化合物具有独特的生理活性,已被广泛应用于抗炎、利尿、免疫、避孕及抗癌等领域。近些年,生物催化与转化在甾体药物中间体合成中发挥的作用日益强大。为了能够合成一些具有潜在价值的新型甾体化合物,以实验室菌种库中保藏的一株Gibberella intermedia C2为研究对象,选取了雄甾烷中一种有广泛用途的化合物4-雄甾烯-3、17-二酮(简称雄烯二酮,AD)为底物进行生物转化。转化液经提取分离,最终获得2个转化产物,经结构鉴定分别为15α-OH-AD和11α,15α-diOH-AD。转化机制研究发现,G.intermedia C2先将底物的15位羟基化生成15α-OHAD,再将其11位羟基化形成双羟基产物。赤霉菌能够特异性、有序地完成对AD的两步羟化反应。此外,通过工艺优化,确定了羟化4AD反应的最适工艺参数如下:发酵培养基的初始pH 6.5,装液量30ml/250ml,底物浓度6.0g/L,转化温度28℃,摇床转速220r/min,转化周期为84h。此时,底物AD的摩尔转化率达到81.5%。     

表达3-甾酮-△1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。     

高效液相色谱-质谱联用法分析微生物降解植物甾醇为雄甾烯酮

采用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC/MS)分析测定植物甾醇侧链降解过程中产物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)及雄甾4-烯-3,17-二酮(AD).其中液相色谱的条件为色谱柱Alltima C18ODS-2(5μm,250 mm×4.6 mm);流动相甲醇:水(V/V=7:3);流速1 mL/min;柱温室温;紫外检测器的检测波长244 nm.质谱为ZMD Micromass电喷雾质谱仪.结果测得ADD与AD标准样品的保留时间分别为9.70 min与11.13 min,发酵样品的HPLC与MS图谱与ADD与AD标准样品的图谱一致.采用高效液相色谱法定量ADD与AD的线性范围在0.01 mg/mL～0.09 mg/mL,产物回收率分别为102.6%与105.90%,日内精密度分别为3.02%与3.08%,日间RSD分别为3.50%与3.24%.该方法灵敏度高、选择性好、操作简便、定量准确,适用植物甾醇微生物侧链降解过程中产物的分析及产品质量控制.     

β-环糊精对甾体微生物羟化反应的影响

考察了β-环糊精(β-cyclodextrin, CD)对雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-diorle,AD)在水中的溶解度及微生物对其11а羟化反应的影响,结果表明β-环糊精能显著提高底物AD在发酵培养基中的溶解度,增溶效果优于有机溶剂.在底物投料浓度0.2%(w/v)时,与4%无...     

一株高效转化Phytosterol为雄甾烯酮菌株的筛选与鉴定

从保藏的200多株菌中筛选出1株高效转化植物甾醇为4-烯-雄甾-3,17-二酮和1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮的菌株,并对该菌进行了形态、生理生化的研究。结果发现菌株ST06可以利用多种碳源,可以水解淀粉,但不利用纤微素。用16SrDNA的方法对其进行鉴定,发现与Bacillus属Bacillus amyloiquefaciens的相似性最高,达到99．9％,将该菌株命名为Bacillus amyloiquefaciens ST06。该菌在培养温度30℃,pH7．0,转速220r／min,转化时间7d,底物添加量为0．3％时,ADD与AD的总得率高达40％以上,此时底物转化率高达93．7％。     

总状毛霉对4-烯-3-酮甾体的生物转化研究

从土样中筛选到一株能转化甾体的菌株,经形态观察,鉴定为总状毛霉(Mucor racemosus)。首次利用该菌株对4-烯-3-酮类甾体衍生物进行生物转化,目的是合成具有潜在活性的羟基类4-烯-3-酮衍生物。转化条件为27℃,220r/min振荡培养4d。转化产物经乙酸乙酯萃取,用硅胶柱层析法分离,通过红外、质谱和核磁分析确定了甾体转化产物的化学结构。黄体酮生物转化得到的产物是14α-羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮和7α,14α-二羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮;4-雄烯二酮的转化产物是14α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮1、4α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮和6α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮。研究结果表明总状毛霉具有转化甾体的能力,对4-烯-3-酮类甾体进行生物转化的主要产物是14α-羟基甾体衍生物。     

偶联羟化反应和辅酶再生体系产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可以用来制备β-甾酮,地塞米松和其他类固醇化合物。3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)是由两个亚基即末端氧化亚基(KshA)和铁氧还蛋白还原亚基(KshB)构成的。在本研究中,人工合成了来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的kshA和kshB基因,通过优化表达载体促进了KshA和KshB在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达,并探究了催化体系中KSH还原亚基和氧化亚基的最适添加比例。此外,KSH转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为9-OH-AD的过程中需要辅酶NADH。本研究构建了羟基化反应与利用葡萄糖脱氢酶(GDH)的NADH辅酶再生反应的偶联体系。为了进一步提高转化效率,本研究进行了转化条件的优化,并采取了分批补料的策略,最终9-OH-AD产量为4.78 g/L,转化率为96.7%。此种酶介导的转化生产9-OH-AD的方法为甾体药物生产提供了一种环境友好和经济实用型的新策略。     

新月弯孢霉AS 3.4381对新型甾体底物C11β-羟基化

应用本实验室保藏的新月弯孢霉Curvularia lunataAS 3.4381对新型甾体化合物(Ⅰ)(16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮)作为底物进行生物转化C11β-羟基化反应的研究。实验研究结果表明,采用Ⅱ级发酵的工艺,收获新月弯孢霉菌丝体作为生物催化剂,在磷酸缓冲液介质体系中,对化合物Ⅰ的C11位实现β羟基化,生成皮质激素药物。测试数据TLC,MS,IR及1H NMR证明了该产物的化学结构,表明生物转化产物为C11β-羟基-16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α，17α，21 三羟基孕甾-1，4 二烯 3，20 二酮

选育到一株对16β-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力。在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮

选育到一株对16β-甲基,17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21-乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力.在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,11α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认.     

2-12烷基-6-甲氧基环己基-2,5-二烯-1,4-二酮(DMDD)抗弥漫大B淋巴瘤的作用及机制*

目的:探讨2-12烷基-6-甲氧基环己基-2,5-二烯-1,4-二酮(DMDD)抗弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)的作用及分子机制。方法:动物实验取4周龄BALB/C小鼠,分5组,20只/组,腹股沟注射DLBCL细胞株OCI-LY19细胞1 × 10⁷ cells/ml 每只0.1 ml,两天后分别灌胃0、1、5、25、125 mg/kg剂量的DMDD,1次/2天,给药的第18日,杀10只小鼠,取瘤组织称重,记录剩余小鼠的生存期。细胞实验取OCI-LY19细胞加入96孔培养板,每孔100 μl 1×10⁵ cells/ml,分别加入100 μl DMDD使其终浓度分别为0、1、5、25和125 μmol/L,作用0、24、48和72 h,设三复孔,MTS法检测细胞增殖活性;根据细胞增殖实验结果,选择0 μmol/L、5 μmol/L和25 μmol/L的DMDD作为后续用药浓度作用OCI-LY19细胞24 h,流式细胞仪分析凋亡率,hoechst染色观察细胞核型,JC-1染色观察线粒体膜电位,LDH释放实验评估药物细胞毒性,qPCR、Western blot分析基因转录和表达水平。结果:动物实验表明:与0 mg/kg用药组比,1～125 mg/kg DMDD能抑制小鼠瘤组织生长并延长其生存期(P＜0.01)。细胞实验表明:DMDD用药组OCI-LY19细胞增殖活性明显降低、凋亡水平显著增加(P＜0.01),细胞核出现碎裂、凝集和凋亡小体及线粒体膜电位下降,LDH释放率显著增加(P＜0.01),细胞内caspase-3和bax基因的转录表达和IκBα的磷酸化水平显著上调,bcl-2、bcl-xL、jak2和stat3基因的转录和蛋白表达水平明显受抑(P＜0.01)。结论:DMDD通过抑制JAK2/STAT3和NF-κB信号通路中JAK2、STAT3和p-IκBα的表达,下调BCL-2/BAX、活化Caspase-3,最终激活OCI-LY19细胞线粒体凋亡的内源性通路而促进了DLBCL细胞凋亡,抑制了OCI-LY19细胞增殖,具有抗DLBCL的作用。     

一种新的抗菌药物靶标蛋白质(3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶)的克隆、表达、纯化及酶活性鉴定

[目的]核黄素( vitamin B12,riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物,对生物体的生物合成至关重要.如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素( flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖.3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase,DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一.在镁离子存在的情况下,DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5 -phosphate,Ru5P)转换成3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate,DHBP)和甲酸盐(formate),生成的DHBP为核黄素合成的必需原料之一.人类没有合成核黄素的相关途径,因此细菌参与合成核黄素的DHBPs等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点.本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定,为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础.[方法]利用PCR技术扩增DHBPs基因,构建重组表达载体pW28-DHBPs.将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21( DE3)中表达,用Ni离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs后,进行酶学性质鉴定.[结果]酶切和测序证实成功构建了质粒pW28-DHBPs,在E.coli BL21中表达了可溶性DHBPs,纯化后获得了纯度为95％的靶蛋白质,经分子筛分析DHBPs在溶液中以二聚体形式存在.对DHBPs进行酶学性质分析表明,在25℃、pH为7.5和Mg2+存在的情况下,DHBPs具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP和甲酸盐的活性.[结论]第一次成功克隆并在E.coli BL21中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs,纯化后的重组DHBPs具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性,这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础.