尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的研究——Ⅱ.透明质酸酶的纯化和性质

用CM-Sephadex C-50,Sephadex G-75以及CM-Sephadex C-25柱层析,从尖吻蝮蛇毒中分离提纯透明质酸酶,得到一个电泳均一的纯品,活力提高45倍。纯品不具有出血活性。用凝胶过滤方法测得分子量为33,000±330,等电点约10.3,PAS染色证实是糖蛋白。纯化的透明质酸酶的最适pH为3.5～5.0,最适温度是37℃,在中性和碱性环境中迅速失活,不耐热。Fe~( )、Cu~( )、肝素对酶活力有明显的抑制作用。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的分离及其生物活性的研究

用二乙氨乙基纤维素柱层析法将尖吻蝮蛇毒分成15个组分,并对粗蛇毒及各分离组分进行了各种生物活力的测定,结果表明:1.粗蛇毒中存在有精氨酸酯酶,蛋白水解酶、碱性磷酸酶,磷酸二酯酶,5′—磷酸二酯酶,5′—核苷酸酶,ADP酶、ATP酶,L—氨基酸氧化酶及磷酸酯酶A等10种酶活力;但不存在胆碱酯酶及核糖核酸酶的活力;2.蛋白水解酶,5′—核苷酸酶及ADP酶普遍存在于粗蛇毒经分离后的各组分中;3.精氨酸酯酶存在于组分6—13中,以第8组分的活性最高;4.第1及5—13组分显示有较高的凝血活性,第1—2组分及9—15组分显示有出血毒,第12(小鼠死亡率2/5)及第13组分(小鼠死亡率3/5)显示有较高的毒性;第1—2,9—15组分显示有纤溶活性。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究 Ⅱ.酶学与血液学活性的研究

对四个凝血酶样成分(TLP)的酶学性质的比较研究表明,它们都具有凝结(血)活性和精氨酸酯酶活性。其凝结活力TLP_4>TLP_3>TLP_1>TLP_2,Ca~(++)有激活作用,但不被肝素、EDTA所抑制;精氨酸酯酶活力以TLP_1、TLP_2较高,Ca~(++)、EDTA无明显的激活或抑制作用;TLP_1对热比较稳定,TLP_4对于酸碱变化比较稳定。经动物体内试验表明,TLP_1、TLP_2具有较强的去纤抗凝作用,TLP_3、TLP_4不显示抗凝作用,而显示出较强的促凝血作用。结果表明,尖吻蝮蛇毒与美洲矛头蝮蛇毒一样,同时含有去纤酶(Defibrase)和蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)。这一结果对该蛇毒的研究与应用是很有意义的。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究Ⅱ.酶学与血液学活的研究

对四个凝血酶样成分（TLP）的酶学性质的比较研究表明，它们都具有凝结（血）活性和精氨酸酯酶活性。其凝结活力TLP[4]>TLP[3]>TLP[1]>TLP[2]，Ca[++]有激活作用，但不被肝素、EDTA所抑制；精氨酸酯酶活力以TLP[1]、TLP[2]较高，Ca[++]、EDTA无明显的激活或抑制作用；TLP[1]对热比较稳定，TLP[4]对于酸碱变化比较稳定。经动物体内试验表明，TLP[1]、TLP[2]具有较强的去纤抗凝作用，TLP[3]、TLP[4]不显示抗凝作用，而显示出较强的促凝血作用。结果表明，尖吻蝮蛇毒美洲矛头蝮蛇毒一样，同时含有去纤酶（Defibrase）和蛇毒凝血酶（Hemocoagulaes）。这一结果对该蛇毒的研究与应用是很意义的。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)人工室外孵化试验

目的　研究在自然环境条件下人工孵化尖吻蝮蛇卵的孵化成活率。　方法　试验于 2 0 0 1年 6～9月在湖南永州之野异蛇实业有限公司试验蛇场内进行。试验基地室内外结合室内面积为 4 m× 3 m,建成多层立体式蛇窝。室外面积为 1 5 m× 1 0 m,灌木和杂草覆盖度 90 %以上 ,有 1个 3 m× 2 m的饮水池 ,供蛇饮水。种蛇 1 5条。孵化湿度 75 %～ 85 % ,温度比场外自然环境温度略低 2～ 3℃。　结果　尖吻蝮蛇平均产卵数为 1 4 .3枚 ;平均孵化天数为 2 2 .5天 ,孵化率为 95 %以上。　结论　在自然环境条件下可以人工孵化尖吻蝮蛇卵 ,而且受精良好的雌尖吻蝮蛇卵出壳率高     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究——Ⅲ.蛇毒凝血酶止血效应的研究

将纯化得到的蛇毒凝血酶(TLE_3、TLE_4),经家兔体内实验表明,2—3凝血酶单位/kg体重剂量能显著地使家兔全血凝血时间缩短1/3—1/2。药后1小时即有促凝作用,以2—4小时凝血(止血)效应最强,12小时已消失。与Holleman, W. H.等自美洲矛头蝮蛇毒中得到的蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)相似。经家兔及家犬实验性创伤止血实验表明,对创伤出血有止血作用。     

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的研究——Ⅰ.三个毒性组分的纯化

从尖吻蝮(五步蛇)蛇毒中用DEAE-Sephadex A-50,Sephadex G-75,DEAE 纤维素和CM-Sephadex C-25柱层析分离纯化,得到三个毒性组分,分别简称为AaT-Ⅰ,AaT-Ⅱ和AaT-Ⅲ。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂免疫电泳鉴定,均表现均一。AaT-Ⅰ和AaT-Ⅱ是酸性蛋白质,等电点分别是4.6及5.3。AaT-Ⅲ是碱性蛋白质,pI>9。它们的分子量均约为22000。     

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的研究——Ⅰ.三个毒性组分的纯化

从尖吻蝮(五步蛇)蛇毒中用DEAE-Sephadex A-50,Sephadex G-75,DEAE纤维素和CM-Sephadex C-25柱层析分离纯化,得到三个毒性组分,分别简称为AaT-Ⅰ,AaT-Ⅱ和AaT-Ⅲ。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂免疫电泳鉴定,均表现均一。AaT-Ⅰ和AaT-Ⅱ是酸性蛋白质,等电点分别是4.6及5.3。AaT-Ⅲ是碱性蛋白质,pI>9。它们的分子量均约为22000。     

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒去纤维蛋白酶(去纤酶)对家犬体内抗凝血作用

分别使用5微克/公斤、25微克/公斤、100微克/公斤的剂量,对15只家犬进行了尖吻蝮蛇毒去纤维蛋白酶(简称去纤酶)抗凝血作用的研究。 去纤酶可使三组实验狗(每组5只)血浆中纤维蛋白元非常显著(P<0.01)地降低。由于纤维蛋白元的降低而产生的抗凝血作用亦是显著的(给药后5小时所取得的血样在37℃放置24小时以上不凝)这一显著的抗凝血作用至少可以持续24小时。未观察到自发性出血现象或其他毒付作用。表明去纤酶具有较为安全,显著的抗凝血作用。     

福建产尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的柱层析分离及酶活力和某些生理效应的测定

用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A—50(DEAE-Sephadex A—50)对福建产尖吻蝮蛇蛇毒进行柱层析分离,获得11个蛋白峰。其中第一峰具有蛋白水解酶及磷酸二酯酶活力,同时还有纤维蛋白溶解作用及局部出血作用。第Ⅵ峰具有较强的精氨酸酯酶活力及凝血酶样的直接凝血效应。第Ⅰ及Ⅳ峰能明显延长血液凝固时间,呈抗凝血效应。第Ⅹ峰具有明显的毒性作用,腹腔注射于小白鼠,可致远隔部位的皮下、肌肉,胸壁内侧以及腹腔等处出血甚至死亡。 尖吻蝮蛇粗毒具有较高的蛋白水解酶、精氨酸酯酶、5′一核苷酸酶及磷酸二酯酶的活力,而碱性磷酸单酯酶、L—氨基酸氧化酶及磷酯酶A的活力均较低,胆碱酯酶的活力近于零。     

尖吻蝮(Deinagkistron acutus)生长过程不同时期排毒量及蛇毒组分的变化

对人工培育的4个年龄段尖吻蝮蛇毒和野生成体尖吻蝮蛇毒进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.结果显示3龄以前尖吻蝮蛇毒蛋白电泳图谱,无论是在分带、泳动率及相应组分的量等方面,均呈现一定的差异,但随着尖吻蝮蛇龄的增长,蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇蛇毒蛋白电泳图谱越来越接近.3龄尖吻蝮生长发育达到性成熟,其蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇趋于一致.蛇毒组分的变化,提示了尖吻蝮的生长发育进程.     

五步蛇(尖吻蝮)

别名又叫蕲蛇、祁蛇、白花蛇、棋盘蛇等,是我国常见剧毒蛇之一。该蛇主要分布在我国的江南各省,国外仅发现越南北部有分布,所以算是我国的特产了。五步蛇头呈三角形,吻端尖而向前上方翘起,故叫尖吻蝮,上领前方两侧长有很长的管状毒牙,     

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒出血毒素Ⅰ的萤光光谱、萤光淬灭以及和出血活性的关系

根据徐洵等人的分离方法,我们从皖南山区尖吻蝮蛇蛇毒中得到出血毒素Ⅰ(AaH-1),它的萤光激发峰在284nm,发射峰在350nm,表现出Trp残基的萤光光谱。AaH-1的萤光强度和峰位随pH值的升高而增强且红移,在pH5～6萤光强度出现跃增,活性从无到有。pH7～9萤光强度稳定,出血活性的变化规律与此相似。升温到50℃以上其萤光强度急骤下降,并失活。一定浓度的SDS,EDTA均使AaH-1的萤光强度下降,出血活性也减弱。表明能改变AaH-1的pH环境、构象或使之变性的因素都能使它的萤光强度和出血活性同时发生相应的改变。AaH-1的萤光能分别被Ⅰ~-和丙烯酰胺碰撞淬灭,从萤光峰位和丙烯酰胺淬灭常数,可见Trp残基处于这些淬灭剂可以作用的位置。NBS能氧化AaH-1的Trp残基的吲哚环,而使Trp残基的萤光淬灭,致使AaH-1的活性也相应地减弱,说明Trp残基与出血活性有关。     

尖吻蝮（Deinagkistrodon acutus）生长过程不同时期排毒量及蛇毒组分的变化

对人工培育的4个年龄段尖吻蝮蛇毒和野生成体尖吻蝮蛇毒进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果显示：3龄以前尖吻蝮蛇毒蛋白电泳图谱,无论是在分带、泳动率及相应组分的量等方面,均呈现一定的差异,但随着尖吻蝮蛇龄的增长,蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇蛇毒蛋白电泳图谱越来越接近。3龄尖吻蝮生长发育达到性成熟,其蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇趋于一致。蛇毒组分的变化,提示了尖吻蝮的生长发育进程。     

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素的纯化与部分性质

目的　被尖吻蝮蛇 （ Ｄｉｅｎａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ） 咬伤会引起严重的出血, 对蛇毒出血毒素的研究有利于治疗蛇伤出血药物筛选。 方法　采用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５, Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０, Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００ 和两次 Ｐ Ｂ Ｅ 聚焦层析纯化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和等电聚焦电泳测定纯化样品的纯度和等电点。氨基酸组成用自动氨基酸分析仪测定。以小鼠背部皮下注射部位出血斑的面积来确定最小出血剂量和常规的方法测定酶活性。结果　从尖吻蝮蛇毒中纯化到一个相对分子量为５６ ０００ 的出血毒素 （ Ｄａ Ｈ Ｔ３）, 经氨基酸组成测定计算,它由 ４８７ 个氨基酸残基组成。此成分在 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ上显示出一条均一的蛋白染色带, 其ｐ Ｉ为５５０。该出血成分的最小出血剂量是 ２６μｇ, 具有蛋白水解酶活力, 其活力为 ３６８, 但没有精氨酯酶和磷脂酶 Ａ２ 活力。当加入 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 螯合剂去除金属离子后, 它们的出血活力和蛋白水解酶活力均丧失。 结论　这是从大陆尖吻蝮蛇毒中获得的一个新的出血金属蛋白酶 （ Ｄａ Ｈ Ｔ３）。     

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素DaHT-3的纯化与性质

被尖吻蝮蛇咬伤会引起严重的出血,对蛇毒出血毒素的研究有利于治疗蛇伤出血药物的筛选.通过SephadexG-75,DEAE-SephadexA-50,SephadexG-200和两次PBE聚焦层析,从尖吻蝮蛇(Dienagkistrodonacutus)蛇毒中纯化到一个分子量为56000的出血毒素(DaHT-3),经氨基酸组成测定计算,由487个氨基酸残基组成.此成分在SDS-PAGE上显示出一条均一的蛋白染色带,用等电聚焦电泳测定,其pI为5.50.该出血成分的最小出血剂量是2.6μg,具有蛋白水解酶活力,其活力为3.68,但没有精氨酸酯酶和磷脂酶A2活力.用红外光谱仪研究DaHT-3在溶液中酰胺I带的吸收谱,该毒素含有31.8%的α螺旋、56.1%的β折叠和12.1%的转角;当加入EDTA螯合剂去除金属离子后,它们的α螺旋、β折叠、转角和无规卷曲分别变为11%、26.4%、46.2%和16.5%,而出血活力和蛋白水解酶活力均丧失,表明该出血毒素是金属蛋白酶     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。