结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用

目的：探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法：将已构建的含5种目的基因的表达载体（pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6）,分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2＋亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果：五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论：Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6 和分泌蛋白 Hsp16.3 体外对人肝癌细胞HepG-2 的作用*

目的:探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hsp16.3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果:三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度10μg/ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、80μg/ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论:结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16．3、Ag85B-ESAT6和分泌蛋白Hspl6．3体外对人肝癌细胞HepG-2的作用

目的：探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hspl6．3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hspl6-3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法：将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hspl6．3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hspl6．3,分别转入宿主菌EcoliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hspl6．3、Ag85B-ESAT6和Hspl6．3三种蛋白,采用Ni^2＋亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果：三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度101xg／ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、801μg／ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论：结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。     

Poly I∶C联合BCG-CpG复合佐剂对结核亚单位疫苗免疫效果的影响

目的探讨聚肌胞苷酸(Poly I∶C)联合BCG-CpG复合佐剂(BCG-CpG-DNA+Al,简称BC02)对结核亚单位疫苗的免疫效果是否有增强作用。方法 BALB/c小鼠分成5组,3组分别免疫含有不同剂量poly I∶C(10、25、50μg/剂)的结核亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)3针,间隔10 d;2组分别免疫PBS或(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02作为对照。末次免疫后第7 d,分离脾淋巴细胞,进行抗原特异性的IFN-γELISPOT检测、ELISA检测和淋巴细胞增殖检测以评价细胞免疫应答。豚鼠分成4组,1组免疫含有50μg poly I∶C/剂的新亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)3针,间隔10 d;3组分别免疫(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02疫苗、生理盐水和BCG作为对照。末次免疫30 d后,每只豚鼠皮下攻击250 CFU结核分枝杆菌。41 d后,解剖豚鼠,进行肝、脾、肺脏器综合病变评分和脾菌计数以评价保护力。结果含不同剂量poly I∶C的(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞分别经Ag85b和ESAT6-CFP10多肽刺激后,分泌IFN-γ的抗原特异性T细胞频数、IFN-γ分泌量和细胞增殖指数均较(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02)组大幅度提高,且应答强度与poly I∶C呈现较为明显的量效关系。(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)组豚鼠脏器综合病变指数(27.5±20.4)和脾菌分离数[(4.22±0.59)log10CFU]均低于(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02组[35.8±27.3,(5.19±0.66)log10CFU],其中脾菌分离数的差异有显著统计学意义(P=0.003 0)。结论 Poly I∶C佐剂对结核亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02诱导的细胞免疫应答和抗结核保护力均有一定的增强效果。     

结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果

以编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT 6和MPT6 3的基因为插入片段 ,构建核酸疫苗联合免疫小鼠。以原核表达纯化的抗原为检测物 ,检测了抗原特异性的抗体和γ 干扰素的形成。研究表明 ,组合核酸疫苗第 3次免疫后 2 1天 ,实验小鼠血清中Ag85B抗体滴度达到 10 5以上 ,Ag85B抗原刺激产生的特异性γ 干扰素达到 (17.0± 7.0 )u/ml。组合疫苗虽然没有提高小鼠血清中ESAT 6及MPT6 3蛋白的特异性抗体滴度 ,但仍显著刺激产生了两种特异性的 γ 干扰素。攻毒实验表明 ,经组合疫苗免疫后小鼠肺部结核杆菌数量显著下降。肺部切片显示 ,免疫小鼠病理状况较对照组有明显改善。因此 ,研究提示Ag85B等组合核酸疫苗具有较好的结核病预防效果。     

结核分枝杆菌CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原真核共表达载体的构建与表达

CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要免疫优势抗原。为了构建一种可同时表达这4种抗原的真核多基因共表达载体pcDNA-CFP10-ESAT6-Ag85A-Ag85B(pcDNA-CEAB),并利用HEK 293T细胞对其体外表达进行检测。采用酶切、连接的方法,将CFP10和ESAT6编码基因以(Gly4Ser)3蛋白Linker连接,插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加尾信号BGH pA之间,使两者融合表达,将Ag85A和Ag85B编码基因以内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)序列连接,并赋予RSV启动子和加尾信号BGH pA,使两者在RSV启动子作用下独立表达。重组质粒经酶切及测序验证后转染至HEK 293T细胞中进行体外表达实验,48 h后提取总蛋白,利用CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B特异性抗体进行Western blotting检测。结果显示多基因共表达载体pcDNA-CEAB在真核细胞HEK 293T中得到表达,且CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原能被相应的特异性抗体所识别,表明质粒pcDNA-CEAB构建正确,这为进一步研究其免疫原性和免疫保护效果奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

目的研究结核分枝杆菌（MTB）ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因（atg）分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3及其合成肽在小鼠体内诱导的免疫应答

目的比较结核分枝杆菌Hsp16.3和Hsp16.3合成肽在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法80只BALB/c小鼠随机分5组共免疫3次,间隔2周。分别于0、2、4、6、8周采集血液,ELISA法检测在抗原Hsp16.3和Hsp16.3合成肽包被时血清中的抗体浓度及第8周时血清中的抗体滴度。末次免疫完成后4周,取每组8只免疫小鼠分离脾淋巴细胞,用Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分别刺激后,MTT法测定脾淋巴细胞的增殖指数,     

结核分枝杆菌多表位诊断抗原的制备

将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)多个B细胞预测表位串联表达(命名为B102),并初步评价其作为诊断抗原的血清学诊断价值。将MtbPstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6个蛋白的11个B细胞预测表位串联,加入合适的连接臂后全基因合成;将多表位片段插入带有TRX标签的表达质粒中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并利用Ni~(2+)-Chelating亲和层析和DEAE阴离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western blotting (WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立Mtb抗体检测竞争法ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。目的蛋白以包涵体形式存在,其表达量约占菌体总蛋白的31.25%,经纯化及复性后蛋白B102可溶性存在,浓度为3.124mg/mL,纯度为96.71%;WB实验表明目的蛋白能与Mtb阳性血清相应抗体发生反应。对60份Mtb阳性血清及60份Mtb阴性血清进行检测得出其灵敏度为90.00%,特异性为93.33%,阳性预测值为93.10%,阴性预测值为90.32%,符合率为91.67%,McNemer检验的结果提示与"金标准"诊断结果无差异,Kappa=0.833,提示两种方法诊断结果一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性优异的Mtb多表位诊断抗原,作为诊断抗原可以应用于Mtb的血清学检测中。     

结核分枝杆菌Rv1886c的原核表达及其免疫生物学特性

【目的】Rv1886c基因编码的Ag85B是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染早期的分泌蛋白,本研究对其所诱导的免疫应答特性进行了探索。【方法】对Ag85B进行原核表达和鉴定,并通过夹心ELISA、间接ELISA及ELISPOT方法测定其诱导的细胞免疫和体液免疫应答水平。【结果】SDS-PAGE及Western blot鉴定结果表明,以包涵体形式表达的Ag85B蛋白,经变性、复性后能与结核病人的抗血清及免疫重组李斯特菌LM-Ag85B的小鼠抗血清发生特异性反应,表明His-Ag85B融合蛋白具有较好的免疫活性。将纯化的Ag85B蛋白皮下免疫C57BL/6小鼠,夹心ELISA的测定结果表明,Ag85B蛋白免疫组诱导小鼠产生的特异性IFN-γ水平显著高于IL-4的水平(P0.001),呈现Th1型细胞免疫应答趋势;以结核菌素PPD作为包被抗原,通过间接ELISA测定的血清抗体效价达到1∶6400,表明Ag85B也能诱导有效的体液免疫应答。此外,以尾静脉途径初次免疫小鼠42天时,ELISPOT测定结果显示,结核分枝杆菌H37Rv诱导小鼠产生Ag85B240-259特异性的IFN-γ水平极显著高于卡介苗(BCG)免疫组(P0.001)。【结论】Ag85B蛋白能激发小鼠产生较强的Th1型细胞免疫应答和较好的体液免疫应答;BCG单次免疫后诱导小鼠产生的Ag85B特异的细胞免疫应答水平较低。本研究为揭示结核分枝杆菌的致病机理、新型疫苗的研制和早期诊断试剂的开发奠定了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。