Medium optimization of α-glucosidase inhibitors production by response surface analysis

[目的]采用响应面法对戈壁三素链霉菌PW409发酵合成α-糖苷酶抑制剂的培养基进行优化.[方法]采用Plackett-Burman法筛选影响α-糖苷酶抑制剂产生的关键因素,用最陡爬坡试验逼近关键因素的最大响应区域,采用Box-Behnken设计以及响应面分析法,得到各因素的最佳浓度,通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对发酵液中α-糖苷酶抑制剂进行定量分析.[结果]发酵培养基中可溶性淀粉、KNO3和K2HPO4的浓度对α-糖苷酶抑制剂的产量影响较大.优化后的培养基组成为:可溶性淀粉9.01 g/L,KNO311.0 g/L,K2HPO4 0.32 g/L,MgSO4·7H2O 0.50 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,pH 7.5.[结论]在此优化条件下,链霉菌PW409发酵液对麦芽糖苷酶的半数抑制浓度IC50为22 mg/L,抑制活性较优化前提高了近10倍.发酵液中的1-脱氧野尻霉素含量可达7.84 mg/L,较优化前提高了668倍,米格列醇的含量可达0.94 mg/L,较优化前提高了10倍.     

应用柱前衍生化高效液相色谱法开辟了一种简单、快速的DNJ产生菌的筛选途径

【目的】应用柱前衍生化高效液相色谱法筛选产1-脱氧野尻霉素(DNJ)菌株,并对其进行系统鉴定。【方法】利用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)柱前衍生化高效液相色谱法筛选DNJ产生菌;通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rRNA序列相似性分析等多项分类方法对DNJ产生菌进行鉴定;在10 L发酵罐水平进行发酵研究,利用FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法测定DNJ含量。【结果】从80株具有α-糖苷酶抑制剂活性的土壤放线菌中筛选得到一株DNJ产生菌,菌株编号为PW409,初步确定为戈壁三素链霉菌(Streptomyces gobitrici);发酵研究表明,DNJ为链霉菌PW409的次级代谢产物,发酵液中DNJ浓度为12.1 mg/L。【结论】首次将FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法应用于DNJ产生菌的筛选,并首次报道从戈壁三素链霉菌发酵液中鉴定到DNJ。     

一株新的α-糖苷酶抑制剂生产菌株PW0852的初步研究

从土壤中分离并筛选得到了一株α-糖苷酶抑制剂生产菌PW0852。根据形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rRNA序列相似性分析等多相分类方法, 初步判定菌株PW0852为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。该菌经10 L发酵罐水平发酵, 发酵液中可积累一定量的α-糖苷酶抑制剂。采用膜过滤技术、离子交换树脂吸附及冷冻干燥等方法, 从PW0852发酵液中分离获得混合型α-糖苷酶抑制剂GIB852。GIB852对人类胰腺α-淀粉酶和α-麦芽糖酶都有明显的抑制作用, 其对麦芽糖酶的抑制性比同剂量的市售双糖酶抑制剂米格列醇强28.7倍, 而对α-淀粉酶的抑制性较弱。通过小鼠糖耐量实验, 发现α-糖苷酶抑制剂GIB852对哺乳动物餐后高血糖的形成有明显改善作用, 具有开发为糖尿病药物的潜力。     

丝状真菌Glarea lozoyensis SIIA-F1108产纽莫康定B0发酵条件的研究

【目的】采用响应面法优化丝状真菌Glarea lozoyensis SIIA-F1108发酵生产纽莫康定B_0培养基,提高发酵产量;通过氮源优化,降低发酵液菌体浓度,改善发酵过程的溶氧水平。【方法】采用Plackett-Burman设计和响应面法进行培养基优化,筛选出对纽莫康定B_0产量具有显著影响的因素;通过最陡爬坡实验及Box-Behnken设计,并利用Design-Expert软件对实验数据进行回归分析,得到优化的发酵培养基配方;通过对优化培养基中氮源组分进行全因子实验,最终得到高产量和低菌体浓度发酵培养基。【结果】实验数据表明:甘露醇、脯氨酸和葡萄糖对纽莫康定B_0产量影响最大;最佳浓度分别为甘露醇167.3 g/L、脯氨酸26.1 g/L、葡萄糖28.5 g/L。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵,纽莫康定B_0产量达到了1 840 mg/L,较优化前提高了42%,与预测结果一致。用硫酸铵部分替换棉籽饼粉后,发酵液菌体浓度降低,在100 L发酵罐上对优化后的结果做了进一步的验证,纽莫康定B_0产量达到1 980 mg/L。【结论】模型预测值与实验值有较高吻合度,具备较高可信度和显著性,发酵产量提高了42%,响应面实验设计和分析方法能够有效地用于丝状真菌Glarea lozoyensis SIIA-F1108产纽莫康定B_0发酵培养基进行优化。通过调整培养基中的氮源组成,降低了发酵液菌体浓度,改善了发酵过程的溶氧水平。     

解淀粉芽胞杆菌PC2产抑菌物质培养基及发酵条件优化

【目的】优化解淀粉芽胞杆菌PC2产抑菌活性物质发酵培养基及发酵条件。【方法】以马铃薯葡萄糖液体培养基为基础,依据发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌圈的单因素试验结果,采用Box-Behnken响应面法优化发酵培养基,二次通用旋转组合设计,频率分析法优化发酵条件。【结果】影响发酵液抑菌活性的培养基主要组分为马铃薯、蔗糖和L-谷氨酸钠,最优发酵培养基配方为:马铃薯188.0 g/L,蔗糖22.0 g/L,L-谷氨酸钠1.80 g/L,培养基成本为0.81元/L;最佳发酵条件为:接种量6%、发酵温度30°C、装液量40 mL/250 mL、摇床转速185 r/min、发酵时间24 h、初始pH 7.0。优化后发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为30.82 mm,较优化前的18.22 mm增加了12.60 mm。【结论】优化后的培养基和发酵条件提高了解淀粉芽胞杆菌PC2发酵液的抑菌活性,为该菌株的工业化生产应用提供了依据。     

好氧反硝化细菌N22’种子培养基的优化

目的:优化好氧反硝化细菌N22’的种子培养基,提高对数期末期细菌浓度。方法:采用Plackett-Burman设计对影响N22’细菌浓度的因素进行评估并筛选出具有显著效应的因素KNO3(X3)、KH2PO4(X4)和K2HPO4(X5),经过最陡爬坡实验接近3个因素的最大响应区域后,应用Box-Behnken设计和响应面分析法确定3个因素的最优水平。结果:优化后的种子培养基:柠檬酸钠6g,KNO32.72g,KH2PO41.35g,K2HPO41.12g,MgSO4·7H2O 0.25g,CaCl20.025g/L,FeSO4·7H2O 0.025g,EDTA0.125g/L;蒸馏水1 000mL,初始pH值7.0。优化后发酵液对数期末期细菌浓度达到1.684 0×1012cfu/mL,比优化前1.632 7×1011cfu/mL提高了9.31倍。结论:Plackett-Burman设计结合响应面分析方法优化了菌株N22’的种子培养基。     

阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化

【目的】通过诱变筛选技术选育阿维菌素高产突变株,对其发酵培养基进行响应面优化,提高阿维菌素产量。【方法】采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,结合链霉抗性和卡那霉素抗性筛选法及96深孔板高通量筛选法,筛选阿维菌素高产株。在单因素实验的基础上,应用响应面分析法对其发酵培养基进行优化,最后确定最佳培养基配方。【结果】获得一株遗传性状稳定的阿维菌素高产株K-1A6,其阿维菌素产量达到4.22 g/L,比出发菌株9-39提高了23.4%,在最佳培养基中阿维菌素产量达到5.36 g/L,较优化前提高了27.01%。【结论】通过对阿维链霉菌9-39菌株进行ARTP诱变筛选及发酵培养基优化研究能显著提高阿维菌素的产量。     

Box-Behnken响应面法优化司替霉素B产生菌发酵条件

【背景】粗糙链霉菌(Streptomyces scabrisporus) HBERC-53204是本中心自主分离的一株链霉菌,经鉴定,其产生一种活性化合物司替霉素B (steffimycin B,SMB),对多种动植物重要病原菌具有良好生物活性。【目的】提高SMB发酵水平,拓宽放线菌活性天然产物在农牧业领域的研究及应用。【方法】以本实验室筛选出的一株产SMB的粗糙链霉菌HBERC-53204为研究对象,运用单因素试验筛选培养基的主效碳源、氮源、无机盐及各营养成分最适浓度,并基于单因素试验结果,通过Plackett-Burman(PB)试验设计筛选出显著影响因素,再结合最陡爬坡试验、Box-Behnken (BB)响应面法拟合显著因子与产量的非线性方程求解,进一步优化菌株产SMB的最佳发酵培养基配方。【结果】优化后最佳培养基配方为：葡萄糖36.22 g/L,蛋白胨8.00 g/L,酵母粉8.51 g/L,酸水解酪蛋白1.50 g/L,MgSO₄ 0.68 g/L,KNO₃ 1.00 g/L。经摇瓶验证,优化后SMB效价达到477.26 mg/L...     

重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸培养基的优化

【目的】提高重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)的产量。【方法】使用正交试验设计以及响应面优化法分别对种子培养基及发酵培养基进行优化,确定了重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe的最佳种子培养基及最佳发酵培养基。【结果】重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe最佳种子培养基(g/L):葡萄糖25.0,玉米浆25.0,硫酸铵15.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾2.0,尿素2.0,p H 6.8-7.0;最佳发酵培养基(g/L):葡萄糖110.0,玉米浆7.0,硫酸铵25.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾1.0,柠檬酸钠2.0,谷氨酸1.0,碳酸钙25.0,p H 6.8-7.0;在最佳培养基条件下L-Phe产量最高达到9.14 g/L,较优化前的7.46 g/L提高了22.5%。【结论】通过正交试验和响应面分析对重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe培养基进行优化,明显提高了L-Phe的产量,并确定了葡萄糖、玉米浆和硫酸铵为发酵培养基中影响L-Phe产量的3个关键因子。研究结果为L-Phe的发酵放大提供了依据。     

丁酸梭菌发酵培养基的优化及发酵产物对黄曲霉毒素B1的降解

【背景】丁酸梭菌是专性厌氧的新一代芽孢益生菌,耐热、耐酸、抗逆性强,极具应用价值和开发前景。【目的】优化丁酸梭菌发酵培养基并初步研究其发酵液对黄曲霉菌的抑制作用和降解黄曲霉毒素B₁ (aflatoxin B₁, AFB₁)的能力。【方法】利用响应面法对发酵培养基进行优化,采用牛津杯法对丁酸梭菌发酵液抑制黄曲霉菌生长进行研究,并通过酶联免疫法测定发酵液对AFB₁的降解能力。【结果】优化后的发酵培养基为：葡萄糖18.1g/L,大豆蛋白胨29.7g/L,磷酸氢二钾3.8 g/L,氯化钠2.0 g/L,乙酸钠4.0 g/L,结晶硫酸镁1.2 g/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.3 g/L。优化后的丁酸梭菌生物量由8.99×10⁸个/mL提高至2.28×10⁹个/mL,是优化前的2.54倍。丁酸梭菌发酵液对致病真菌黄曲霉菌的抑菌效果十分显著,其上清液经浓缩后对AFB₁降解72h的降解率达到68.65%,初步分析表明上清液中对AFB₁     

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。     

发酵条件优化及基因簇加倍对厦门霉素生物合成的影响

【目的】优化发酵培养条件及加倍xim基因簇,提高厦门霉素的产量。【方法】采用单因素添加:C源(鼠李糖、葡萄糖酸)、无机N源(KNO3)、稀有金属元素(Sc Cl3)及A-Factor(γ-丁内酯),优化适宜厦门链霉菌318菌株产生厦门霉素的培养条件;通过位点特异性整合将厦门霉素生物合成基因簇进行加倍,构建高产的基因工程菌株厦门链霉菌318Pls1,并对其培养基进行了正交实验优化。【结果】与初产量(15 mg/L)相比,在GYM培养基中进行单因素添加可使318菌株的厦门霉素产量达到20 mg/L;而基因簇加倍菌株318Pls1在GYM培养基上的厦门霉素产量可达35 mg/L,在正交实验优化后的9#培养基中厦门霉素产量可达76.15 mg/L。【结论】对厦门霉素的发酵培养条件进行了优化,并通过基因簇过表达获得了生物合成能力提高的菌株,为进一步提高其产量奠定了基础。     

内生解淀粉芽孢杆菌CC09产Iturin A摇瓶发酵条件优化

【目的】提高内生解淀粉芽孢杆菌CC09发酵产抗菌脂肽Iturin A的产量。【方法】首先采用单因子实验研究了碳源、氮源、NaCl浓度、pH、温度、转速和装液量等因子对CC09产Iturin A能力的影响,然后对其中显著性因子:氮源浓度、pH、温度及装液量4个因素进行正交实验,进一步优化发酵条件。【结果】优化培养基组成及发酵条件可以提高CC09菌株的生长速度及产Iturin A的量,其中可溶性淀粉以及一定比例的蛋白胨和酵母粉是CC09菌株产Iturin A的良好碳源和氮源;培养温度、装液量、培养液pH等也对CC09菌株产Iturin A有显著影响。优化后的培养基成分:可溶性淀粉(碳源)5 g/L、比例为3:1的胰蛋白胨酵母粉混合氮源15 g/L、NaCl 1 g/L;最佳培养条件:pH 6.0、28°C、摇床转速120 r/min、培养瓶装液量20%。【结论】在此条件下,Iturin A的产量可达到690 mg/L,较优化前的138 mg/L提高了4倍。     

毛栓菌产漆酶条件优化及该酶对合成染料脱色的特性

【目的】提高菌株Trametes hirsuta SYBC-L19漆酶产量,并研究该酶对合成染料脱色的性质。【方法】通过单因素和响应面设计,对产漆酶培养基进行优化。【结果】最优培养基为:玉米粉20.0 g/L、马铃薯淀粉32.4 g/L、酒石酸铵2.9 g/L、吐温80 0.5 g/L、CuSO4.5H2O 2.0 mmol/L、香兰素0.54 mmol/L、NaH2PO4.2H2O 2.0 g/L、MgSO4.7H2O0.5 g/L、MnSO4.H2O 0.1 g/L;最佳培养条件为:培养温度30°C,初始pH 6.0,装液量40 mL/250 mL,接种量8%。【结论】培养8 d酶活达35 U/mL,是优化前的39倍。对漆酶催化合成染料脱色进行了考察,发现该酶在60°C下对偶氮类染料AR1和RB5能迅速脱色,5 min内即可完成。     

响应面法优化热带假丝酵母104菌株产羰基还原酶发酵培养基

通过菌种优选得到产高选择性羰基还原酶的热带假丝酵母(Candida tropicalis)104菌株,可不对称还原1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇,对映体过量值>99.9%。采用部分因子实验设计考察发酵培养基中各组分对产酶的影响,结果表明,酵母粉、葡萄糖和NH4Cl浓度对产酶影响显著。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面对3个显著性因素进行分析,得到优化的发酵培养基组成:葡萄糖47.14g/L,酵母粉13.25g/L,NH4Cl2.71g/L,MgSO4·7H2O0.4g/L,KH2PO41g/L和K2HPO41g/L。采用该优化培养基,供试菌株的羰基还原酶活力达851.13U/L,较优化前提高了65.2%。     

重组菌BL21-HTa-cgkZ产κ-卡拉胶酶的发酵条件优化

【目的】优化重组菌BL21-HTa-cgkZ产生κ-卡拉胶酶的发酵条件。【方法】通过单因子筛选和响应面分析方法对在IPTG诱导下的κ-卡拉胶酶的产生菌BL21-HTa-cgkZ进行产酶条件优化。【结果】该菌产酶的最佳培养基组成为：乳糖7 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,CaCl2 0.666 g/L。最佳诱导条件为：在工程菌接种1.55 h后添加IPTG,IPTG的浓度为0.89 mmol/L,诱导时间为24 h,诱导温度为23.03 °C。并确定了在培养基中添加乳糖、Triton X-100对κ-卡拉胶酶分布的影响。【结论】实验结果为产κ-卡拉胶酶工程菌的规模化生产奠定基础。     

利用响应面法优化固氮类芽孢杆菌Paenibacillus sp.1–49的发酵培养基（英文）北大核心CSCD

【目的】固氮类芽孢杆菌Paenibacillus sp.1–49是本实验室分离的具有潜在生物肥料价值的微生物菌剂。该菌在常见的培养基中不能高效生长(OD_(600)≤1)。本文拟优化发酵培养基成分以获得最大菌体生物量。【方法】运用响应面分析中的因素筛选实验设计和最陡爬坡实验以及中心复合设计法,对菌株的发酵培养基进行了响应面优化。【结果】利用响应面优化法最终确定了菌株最佳培养基:蔗糖36.22g/L,Tryptone 5.31 g/L,Yeast Extract 10.92 g/L,Mg SO_4 0.51 g/L,Na Cl 3.5 g/L,Na_2Mo O_4 0.02 g/L,FeS O_4 0.02 g/L。通过摇瓶发酵后菌体OD600=10.280,达到预测值的94.6%。【结论】利用响应面法成功地对Paenibacillus sp.1-49的发酵培养基进行了优化,为该菌株和其他类芽孢杆菌的大规模发酵提供了参考。     

抗肿瘤银杏内生真菌Aspergillus oryzae YX-5发酵 培养基的优化

【目的】对一株具有抗肿瘤活性的银杏内生真菌Aspergillus oryzae YX-5的发酵培养基进行优化。【方法】以发酵后的菌体干重、粗提物质量和粗提物抗肿瘤活性为指标,通过单因素实验选出合适的碳源和氮源,再以选出的碳源、氮源以及K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl共5个因素进行正交实验,确定出最适宜的发酵培养基配方。【结果】YX-5的最佳发酵培养基配方为葡萄糖45 g/L,蛋白胨8 g/L,K2HPO4 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,KCl 1 g/L,FeSO40.01 g/L。优化后菌体干重、代谢物的产量和抗肿瘤活性分别提高了41.88%、226.52%和19.31%。【结论】通过对米曲霉菌(Aspergillus oryzae)YX-5的发酵培养基进行优化,明显提高了粗提物产量和抗肿瘤活性,这对后期规模化发酵中减小发酵规模和降低工作量十分有利。     

利用响应面法优化固氮类芽孢杆菌Paenibacillus sp.1–49的发酵培养基（英文）

【目的】固氮类芽孢杆菌Paenibacillus sp.1–49是本实验室分离的具有潜在生物肥料价值的微生物菌剂。该菌在常见的培养基中不能高效生长(OD_(600)≤1)。本文拟优化发酵培养基成分以获得最大菌体生物量。【方法】运用响应面分析中的因素筛选实验设计和最陡爬坡实验以及中心复合设计法,对菌株的发酵培养基进行了响应面优化。【结果】利用响应面优化法最终确定了菌株最佳培养基:蔗糖36.22g/L,Tryptone 5.31 g/L,Yeast Extract 10.92 g/L,Mg SO_4 0.51 g/L,Na Cl 3.5 g/L,Na_2Mo O_4 0.02 g/L,FeS O_4 0.02 g/L。通过摇瓶发酵后菌体OD600=10.280,达到预测值的94.6%。【结论】利用响应面法成功地对Paenibacillus sp.1-49的发酵培养基进行了优化,为该菌株和其他类芽孢杆菌的大规模发酵提供了参考。     

绞股蓝内生真菌抗大肠杆菌抗菌机制的研究

【目的】药用植物内生真菌是一种新型抗生素的微生物资源,研究绞股蓝内生真菌JY25的抗菌机制对内生真菌的研发具有重要意义。【方法】以二倍稀释法测定发酵液的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);以MIC测定发酵液对大肠杆菌生长的抑制作用;扫描电镜观察发酵液作用下的大肠杆菌形态变化;同时,以β-半乳糖酶、碱性磷酸酶和电导率测定发酵液对细胞膜和细胞壁的损伤效果;采用考马斯亮蓝法检测发酵液对蛋白质合成的影响。【结果】JY25发酵液对大肠杆菌MIC为7 g/L、MBC为14 g/L;MIC浓度的发酵液使细菌对数生长期延迟12 h,菌体形态发生严重的畸形和破损;随着抑菌作用时间的延长,β-半乳糖酶含量增加、电导率增加,同时,实验发现大肠杆菌蛋白质合成异常,未检测到碱性磷酸酶。【结论】绞股蓝内生真菌JY25主要以破坏细菌的细胞膜及影响细菌蛋白质合成而抑制细菌生长。