特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉（Humicola insolerts）H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达*

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

长梗木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

一株纤维素酶高产菌株经ITS序列鉴定并命名为长梗木霉SSL(Trichoderma longi-brachiatum,SSL).利用RT-PCR的方法从该菌株中克隆出内切-1-4-β-D-葡聚糖酶Ⅰ的基因(eg1),该基因全长1386 bp,编码461个氨基酸.序列分析表明:该基因序列与T. longibrachiatum egl1基因具有90%以上的同源性.将该基因的成熟肽编码序列插入到Pichiapastoris表达载体pPIC9k中,构建重组表达质粒pPIC9k-eg1,转化P.pastoris GS115.重组P.pastoris菌株,经甲醇诱导后,胞外重组内切葡聚糖酶Ⅰ的活力达73 U/mL.SDS-PAGE中出现一条明显加强的蛋白质条带,其分子量大约为58 kD.     

长梗木霉内切葡聚糖酶I基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

一株纤维素酶高产菌株经ITS序列鉴定并命名为长梗木霉SSL (Trichoderma longibrachiatum, SSL)。利用RT-PCR的方法从该菌株中克隆出内切-1-4-β-D-葡聚糖酶I的基因 (eg1), 该基因全长1386 bp, 编码461个氨基酸。序列分析表明：该基因序列与T. longibrachiatum egl1基因具有90％以上的同源性。将该基因的成熟肽编码序列插入到Pichia pastoris表达载体ppic9k中, 构建重组表达质粒ppic9k-eg1, 转化P. pa     

中性纤维素酶外切葡聚糖酶CBHⅡ的异源表达

利用聚合酶链式反应（PCR）技术,从本实验室保存的1株特异腐质霉EIM-50上克隆到中性纤维素酶外切葡聚糖酶基因（CBHⅡ）全长序列,大小约为1 586 bp。将其克隆到pPIC9K上,成功构建重组质粒pPIC9K-CBHⅡ,并经电转化引入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,进行异源表达。SDS-PAGE银染结果表明,该重组质粒在毕赤酵母中获得了异源表达。gel pro Analyser软件分析其表达蛋白的表观分子量约为62.548ku。用BandScan软件分析其蛋白表达量为2.3%,即0.738μg/mL（mg/L）。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ（EGⅣ）在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2．11U／mL。     

Expression of Humicola insolens (NC3) endo-β-glucanase Ⅱgene in Pichia pastoris and anylysis of enzymic properties

[目的]在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究.[方法]利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ的cDNA.将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115.[结果]SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达.重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70℃,且在65℃以下具有较好的热稳定性.最适反应pH为6.5,在pH 6.0-7.0之间有较好的稳定性.[结论]用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础.     

内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达

根据绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422菌株内切葡聚糖酶基因egⅡ的cDNA序列,设计特异引物,以重组质粒pTG19-T-egⅡ为模板,扩增得到全长1 194bp的egⅡ成熟肽cDNA片段.将该片段分别克隆到大肠杆菌(Escherichia coil)表达载体pET-28a( )和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌Rosset(DE3)和毕赤酵母GS115中进行了表达.重组大肠杆菌表达蛋白占菌体总蛋白的15%,表达产物无内切葡聚糖酶活性.重组毕赤酵母经甲醇诱导实现了分泌表达,在摇床水平上酶活性达到2 788U/ml.酶学性质分析表明,该酶作用的最适pH为4.5,pH 3.5～6.0范围内酶活性保留在80%以上;最适温度为50℃,55℃以下酶的稳定性在90%以上.     

毕赤酵母中植酸酶和内切葡聚糖酶共表达菌株的构建及其高效表达(英文)

植酸酶和内切葡萄糖苷酶广泛应用于动物饲料添加剂中,能更有效地帮助饲料的利用,同时为动物的生命活动提供必需的重要物质。首先构建重组质粒pPICZα-EG,经过线性化后,电转化到含有植酸酶phyA基因的毕赤酵母感受态细胞中,构成含有植酸酶基因和内切葡萄糖苷酶基因的重组体菌株GS115-phyA-EG。经甲醇诱导后其活性分别达到出发菌株GS115-phyA和GS115-EG的39.4%和56.2%。酶学性质的分析显示,最适反应温度和最适反应的pH值分别为55℃和5.5,植酸酶和内切葡萄糖苷酶在温度为45℃~55℃,pH值为4.5~5.5时,酶活相对稳定,均能达到最高酶活的80%以上。结果表明这种在同一个系统种同时表达2种酶的方法能更好地节约时间和成本,使其在饲料工业的应用上有更广阔的前景。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达*

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ(EGⅣ)在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的表达。采用RT-PCR的方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris-EGⅣ1。在甲醇     

特异腐质霉纤维素酶的研究

由腐植土中分离到一株嗜热真菌,经鉴定为特异腐质霉(Humicola insolens Cooney etEmerson)。研究了这株菌纤维素酶的产生条件和一般性质。菌在含麦麸5％、NaNO0.3％的液体培养基(灭菌前pH7.5,灭菌后pH7.2)中,于45℃培养4天,以羧甲基纤维素钠为底物,每ml滤液酶活力为20个单位。酶作用的最适条件为:pH6.0,温度为65—70℃。该纤维素酶是一种耐热酶,热稳定性较强,70℃保温5分钟后,酶活力剩余88％。底物对该酶的热钝化有较强的保护作用,无底物存在条件下,70℃保温6小时后,酶活力仅剩余1％,而在同样的处理温度和时间,在有底物存在条件下,酶活力可剩余30％。该酶在45℃保温15小时的条件下,pH稳定范围为6.0—9.0。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

采用刚果红染色法从瑞氏木霉cDNA文库中分离到一株具有CMCase活性的阳性克隆 ,测序结果显示该基因所编码的蛋白质为瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ (EGⅢ )。对重组酿酒酵母所产生的EGⅢ进行了酶学性质分析 ,其最适pH为 5 0 ,最适温度为 60℃。检测了酿酒酵母蛋白质分泌系统组分SSO2和SEB1对EGⅢ分泌的影响。结果表明 ,在可过量表达蛋白质分泌系统组分SSO2的酿酒酵母H837中 ,EGⅢ的分泌量最高。由此分析 ,酿酒酵母SSO2蛋白可能在EGⅢ的分泌中 ,是一个限速步骤。通过PCR方法删除EGⅢ基因 5′端非翻译区的 98bp核苷酸序列使EGⅢ表达量提高了 5 3倍。这提示我们 ,瑞氏木霉的EGⅢ基因在酿酒酵母细胞中表达时 ,其mRNA 5′端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列。     

内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究

通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No. DQ782954)信号肽编码序列去除, 然后与表达载体pHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5a, 筛选出阳性转化子DH5 a -pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体, 获得基因工程菌WH320-pHIS1525-G7。刚果红染色和SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达。基因工程菌经优化培养后, 胞外上清液中的酶活力可达889 U, 是出发菌株(即枯草芽孢杆菌C-36)的11.22倍。酶学性质研究表明: 该酶的最适反应温度与pH值分别为65℃与pH 6.0, 在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持在最高酶活的80%以上。     

产中性纤维素酶特异腐质霉H31-3复合诱变研究

中性纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业均具有广泛的应用。采用离子束注入技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉（Humicola insolens）H31-3进行诱变,经发酵筛选获得较高酶活力且传代稳定的正突变菌株H14,制备其原生质体后进行紫外诱变。筛选后得到正突变菌株H14．2,最终CMC酶、滤纸酶活力分别达82．56IU／mL和5．77IU／mL,较原始菌株提高了78．57％和106．81％。     

特异腐质霉纤维素酶的分离纯化与性质

特异腐质霉Humicola insolens(YH-8)能高效合成高稳定性的纤维素酶.由该菌株所产的纤维素酶粗液经过1.5倍酒精沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析,SephadexG-100凝胶过滤,得到电泳纯的纤维素酶组分一个.对这个组分的催化性质(以羧甲基纤维素为底物)进行了研究,该酶的最适催化温度60℃,pH值为5.5,在50℃以下酶的稳定性较好,70℃条件下底物对酶有较强的保护作用,该酶的pH稳定性范围为4～8,zn2 ,ca2 ,Mg2 ,K ,Li 对酶活有促进作用,Mn2 、Co2 、Fe2 、Fe2 对酶活起抑制作用,酶对CMC-Na和水杨素有分解作用,而不分解脱脂棉和滤纸.     

中性内切型纤维素酶在毕赤酵母中高水平表达的研究

中性内切型纤维素酶在纺织及造纸工业具有重要的应用,为了进一步提高从我国草菇中克隆的一种新的中性内切型纤维素酶(EG1)在Pichiapastoris中的表达水平,我们进行了提高基因拷贝数及高密度发酵等多种手段实现其高水平表达的研究。在前期研究的基础上,利用对已整合eg1的重组子再转化的方法,从含有2000μgLZeocin的YPDSZ平板上筛选到高抗Zeocin转化子,在摇瓶培养条件下,该转化子表达量比原来提高了3.8倍,在pH4～8条件下均有稳定表达,接种量(OD600=5.0)表达水平最好,提高甲醇的诱导浓度对表达有显著的促进作用。用3.2L发酵罐进行了高密度发酵,甲醇诱导95.5h后达到最高值,比摇瓶培养再提高了6.4倍,因此利用高抗Zeocin转化子及高密度发酵的手段,使EG1的表达水平提高了34倍,蛋白表达量达8.80mgmL,EG1酶活达到543.36IUmL,实现了中性内切纤维素酶的高水平表达,本研究将大大促进建立我国纺织用纤维素酶大规模高效生产技术。     

康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达

目的：构建纤维素酶EGⅠ原核表达载体,并对表达产物进行初步酶学性质研究。方法：以康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增内切葡聚糖酶EGⅠ,重组到T7启动子控制下的质粒pET.His中,构建重组质粒pET.His-EGⅠ,并将其转化至E.coli BL21（DE3）plysS感受态细胞中,经0.4mmol/L的IPTG诱导表达后对其表达产物进行13%SDS-PAGE分析。结果：SDS-PAGE电泳显示EGⅠ在大肠杆菌中得到了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,分子量约45kDa。初步研究表明：重组蛋白具有内切葡聚糖酶活性,最适pH为6.0,温度在30℃～40℃时酶活稳定,金属离子Mn2＋对酶活力有明显的促进作用。结论：纤维素酶EGⅠ在大肠杆菌中成功表达,具有一定活性。     

平菇漆酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

采用RTPCR技术克隆到一个平菇(Pleurotusostreatus)漆酶基因的全长cDNA,命名为lccPo1,其序列提交GenBank,登录号为AY450404。将其ORF克隆到毕赤酵母表达载体pHBM906,转化3株毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168,该漆酶基因在3种毕赤酵母菌株中均实现了分泌表达。3种摇瓶培养条件①25℃,1.0%(VV)甲醇;②20℃,1.0%(VV)甲醇;③20℃,0.5%(VV)甲醇,进行比较研究后发现适当提高甲醇浓度有利于漆酶在低温条件下表达,而降低培养温度到20℃则可以提高漆酶的产量2～6倍。3株重组毕赤酵母在其最适反应条件下测得三者粗酶液最高漆酶酶活分别为3.19UmL[GS115(pHBM565)]、2.56UmL[KM71(pHBM565)]和2.49UmL[SMD1168(pHBM565)]。对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为4.2,最适反应温度约为60℃。重组毕赤酵母GS115(pHBM565)所产酶的热稳定性稍好,在pH稳定性方面三者没有太大差异。     

产外切葡聚糖酶真菌的筛选鉴定及毕赤酵母中的表达

【目的】外切葡聚糖酶是纤维素酶组分中一类对结晶纤维素有降解作用的酶类,如何提高外切葡聚糖酶活力是研究的关键问题。【方法】从筛选鉴定得到的一株产外切葡聚糖酶酶活较高的黑曲霉Asp-524菌株出发,通过PCR技术克隆得到外切葡聚糖酶基因序列,生物学信息分析后,构建了毕赤酵母诱导型表达载体,实现了该基因在毕赤酵母中的成功表达。【结果】抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导5 d后,酶活达到4.74 U/mL。酶学性质分析显示重组外切葡聚糖酶最适pH为5.0,pH稳定性分析显示在pH为4.0-6.0范围内相对稳定,酶活能保持在最高酶活力的80%以上,最适反应温度为50°C,经60°C保温1 h后,酶活仍能保持80%以上。【结论】结果说明该外切葡聚糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,这一研究为纤维素酶的实际应用奠定了一定基础。     

匍枝根霉组成型内切葡聚糖酶基因的筛选和表达

从匍枝根霉cDNA文库中筛选得到组成型内切葡聚糖酶基因（ zeg1和zeg2）,经比对zeg1和zeg2相似度为86％,有相似的催化活性区域,经CDD（保守序列数据库）分析,该蛋白归属于糖苷水解酶第5家族,对比PDB（蛋白结构数据库）中第五家族的关键催化残基,预测该两个蛋白的第147位的谷氨酸（ E）及199位的色氨酸（ W）为该蛋白的关键催化残基。重组zeg1发酵至20 h时达到最高酶活为0.422 IU/mL;重组zeg2发酵至24 h达到最高酶活为0.509 IU/mL。酶学性质研究表明重组zeg1和zeg2的最适温度均为50℃,最适pH值均为5.0。通过CMC-SDS-PAGE电泳,复性后染色,测得重组zeg1和zeg2的分子量分别约为55 kD和58 kD。