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利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacilusthuringiensis)δ内毒素cryIA(c)全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK2233重组,并引入大肠杆菌JM109中,经IPTG诱导,获得了超量表达的CryIA(c)蛋白。将cryIA(c)全长基因插入链霉菌表达载体pHZ1272中,得到重组质粒pHZ1256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导,通过Westernbloting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZ1256)已表达出相应的CryIA(c)蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ内毒素CryIA(c)对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93%和57%。 相似文献
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环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆 总被引:4,自引:0,他引:4
环状芽孢杆菌(Baciluscirculans)C2总DNA经PstI部分酶切后分离2~10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichiacoli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长30kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulansC2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。 相似文献
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HIV—1 SF2株env基因(120)在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
运用基因重组技术,将HIV-1 SF2株编码外膜蛋白gp120的env基因片段与原核载体pBV220进行重组,构建成质粒pBVSF2env,并在大肠杆菌(E.CoilDH10b)中获得表达,经Westemblot反应证实,该重组蛋白与来自HIV-1感染者的血清(含多克隆抗体)发生特异性反应。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌δ—内毒素cryIA(c)基因在大肠杆菌和变铅青链?… 总被引:1,自引:0,他引:1
利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽直菌δ-内毒素cryIA(c)全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体PKK223-3重组,并引入大肠杆菌JM109中,经IPTG诱导,获得了超量表达的CryIA(c)蛋白将cryIA(c)全长基因插入链霉菌表达载体PHZ1272中,得到重组质粒,PHZ1256,将该质粒引入变铅青链霉菌JT46中,经硫链丝菌素诱导,通过W 相似文献
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目的:在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A(SpaA)N端保护区(SpaA-N),并检测其抗原性。方法:利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果:扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论:获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。 相似文献
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美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体 总被引:1,自引:0,他引:1
用限制性内切酶Pst I部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的pCT5质粒,分离得到324bp的片段,将此片段亚克隆到pUC19质粒中,筛选到pUC-AF重组子。从pUC-AF重组子中,用BamHI和HirdⅢ切下324bp的抗冻蛋白基因,再重组到含有SV40病毒启动子的pKSV-10的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。 相似文献
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产气肠杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性?… 总被引:3,自引:0,他引:3
用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆出0.9kb的DNA片段,经DNA测序证明是α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,α-ALDC)基因。将α-ALDC基因重组到质粒,pBV220后,转化大肠杆菌,经筛选获得的高效表达的重组子菌株。 相似文献
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目的:克隆表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)外膜蛋白H基因(ompH)片段并对其进行免疫原性分析。方法:采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果:获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论:pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。 相似文献
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目的:克隆表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)外膜蛋白H基因(ompH)片段并对其进行免疫原性分析。方法:采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果:获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论:pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。 相似文献
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金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础. 相似文献
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在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株. 相似文献
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克隆人白细胞介素-26(human interleukin-26,hIL-26)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。对GenBank上报道的hIL-26基因进行序列分析后设计合成引物,利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA中反转录并扩增得到人成熟肽IL-26基因。将得到的基因克隆到pMD18-T载体中,菌落PCR筛选、酶切鉴定并进行DNA序列分析。用BamHI和EcoRⅠ将目的片段切下,插入表达载体pBV220相应的位点。42℃热诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的20%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,分子筛纯化后纯度达90%以上。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测复性的重组蛋白能促进PBMC合成IFN-γ。 相似文献
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Bacillus licheniformis6816碱性蛋白酶基因在E.coli中的克隆和表达 总被引:4,自引:0,他引:4
用PCR方法从地衣芽孢杆菌6816中扩增了碱性蛋白酶基因(apr),扩增的1.14kb的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-20b中,构建成重组分泌型表达载体pAPR1。pAPR1中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM109(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量为30kD,同核酸序列测定所推导的值相符,表达产物占细胞总蛋白的7.5%,重组菌的酶活比出发菌株提高了3.3倍,研究发现,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时存在前肽自动脱落的现象。 相似文献
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登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV-1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病[1,2]。E蛋白是位于DENV表面的结构蛋白,由495个氨基酸组成,它既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒血清型特异的抗原表位,又有与中和,血凝抑制作用有关的抗原表位,是病毒颗粒的主要包膜蛋白[3]。Modis等研究表明,DENV-2型E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不… 相似文献