抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析

根据抗体基因可变区两端保守序列ＦＲ１和ＦＲ４,设计并化学合成轻重链ＰＣＲ扩增引物。从体外培养细胞ＵＣＨＴ１中提取总ＲＮＡ,反转录成Ｃｄｎａ,以Ｃｄｎａ为模板经ＰＣＲ扩增轻,重链可变区基因片段。将扩增片段克隆至Ｐｕｃ１９质粒,筛选阳性克隆并测序,序列分析结果为重链３６６ｐｂ,编码１２２个氨基酸,轻链３２７ｂｐ,编码１０９个氨基酸     

用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆

应用ＰＣＲ法快速筛查插入有苯丙氨酸脱氨酶ｃＤＮＡ重组阳性克隆。方法：用于ＰＣＲ扩增的引物是位于载体ｐＥＴ２３ｂ启动子处的Ｔ７启动子引物和位于目的基因ＰＡＬｃＤＮＡ３’端终止密码ＴＡＡ处的引物。以灭菌吸头挑一单菌落加入ＰＣＲ体系扩增。结果：在筛查的３个克隆中,有２个阳性克降,并且插入方向正确,经ＤＮＡ序列测定得到进一步证实。结论：以ＰＣＲ方法筛查重组阳性克隆,可以简便快速鉴定插入片段的大小和方面,不     

细胞内RT－PCR扩增免疫球蛋白重链可变区基因

通常,逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）需要高质量的ｍＲＮＡ,操作过程复杂,效率低且易受到ＲＮａｓｅ的破坏,为了简化操作,提高效率,用１０％甲醛盐溶液固定杂交瘤细胞,以ＮＰ－４０渗透化处理细胞后做ＲＴ－ＰＣＲ,获得了大约３５０ｂｐ的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段,与用同一对引物得到的常规ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物一致。这项技术可用于获得特定结构基因片段,连结并扩增嵌合蛋白基因及构建多克隆免疫球蛋白文库等。     

PCR扩增同源重组片段筛选转基因胚胎

使用小鼠乳清酸蛋白基因（ＷＡＰ）启动子控制下的人集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因为显微注射片段,采用ＰＣＲ方法检测了转基因胚,为消除ＰＣＲ扩增中的假阳性结果,构建了两个具有部分同源性的亚克隆片段进行共注射．ＰＣＲ扩增片段跨越这一同源区域,仅当注射的片段能够整合并发生正常重组,转基因整合胚才能以相对高的比例扩增出特异性片段．结果表明,１、２和８细胞期的阳性率分别为１１．１％、５５．５％和４４．４％,较常规ＰＣＲ检测获得更为明确的结论,为在大动物转基因胚胎检测提供了依据     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比     

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

为了获得ＨＩＶ辅助受体ＣＸＣＲ４基因,进一步探索艾滋病（ＡＩＤＳ）的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶链式反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人外周血淋巴细胞中克隆了ＣＸＣＲ４　ｃＤＮＡ基因,得到了预期的１　１００ｂｐ左右的片段。将ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接,并进行了酶切反应鉴定,获得与Ｔ载体正向连接的克隆。测序结果表明：克隆的片段含有一个开放性阅读框架,编码３５２个氨基酸残基。搜索ＧｅｎＢａｎｋ,目标片段与Ｍ９９２９３、ＸＭ０５１２２３、ＸＭ０５１２２４、　ＸＭ０５１２２５有很高的同源性,比较结果显示：克隆的片段包括完整的编码序列,含两个碱基的差异。     

影响RT—PCR产物克隆的因素及其方法的优化

在对１２个以ＲＴ－ＰＣＲ扩增后的ｃＤＮＡ片段进行克隆的工作中,讨论了影响克隆效率的几个因素,并对原有的部分克隆步骤作了优化,取得了对适当长度基因片段进行克隆的快速、简便的方法。     

用DD—PCR法克隆AVP4—8诱导的鼠脑差异表达基因

精氨酸加压素（ＡＶＰ）Ｃ端片段ＡＶＰ４－８,具有增强记忆的功能,它在大鼠脑内引发一系列的生理和生化变化。采用差示ＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）技术,寻找注射ＡＶＰ４－８前后在大鼠海马中差异表达的基因。抽提总ＲＮＡ,以反转录产生的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ,经过９组引物组合,获得了十几个差异片段,挑选其中差异最大的片段ｄｄｌ进行克隆,测序,并与Ｇｅｎｅｄａｎｋ等数据进行同源比较 有找到同源基因,可能是个新基因     

人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因第3内含子的克隆 …

从端粒酶活性呈性阳的水生细胞株人肺ＳＣＰ－Ａ－１中分离了总ＲＮＡ,以此为模板,结合ＲＴ－ＰＣＲ技术和长模板ＰＣＲ技术,用ｈＴＥＲＴ基因特异性引物扩增到一长约２．２ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。将该片纯化后克隆到通用测序本Ｔ－ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ上得到重组质粒。用测引物ＳＰ６和Ｔ７对该片段进行部分双向测序。经序列分析和同源比较推测该片段包含了ｈＴＥＲＴ基因的第３内含子。该结果提示了ＲＴ－ＰＣＲ技术和长模板Ｐ     

大熊猫SRY基因的PCR扩增和克隆

本文采用人ＳＲＹ基因的一对引物,通过ＰＣＲ扩增获得了雄性大熊猫ＳＲＹ基因片段。表明大熊猫存在与人ＳＲＹ基因同源的相应基因,将ＰＣＲ产物与载体ｐＵＣ－Ｅｃｏ－Ｔ连接后,用以转化ＪＭ１０９菌,经过与人ＳＲＹ基因探针菌落杂交筛选获得了大熊猫ＳＲＹ苈在克隆,命名为ｐＡＭＹ０．６,其插入片段为相应于人ＳＲＹ基因保守区在内的一段约６０９ｂｐＤＮＡ。此外,还制作和比较分析了人和大熊猫基因片段的限制酶图谱。     

PCR筛选阳性克隆方法的改进

ＰＣＲ筛选阳性克隆具有简便、快速的优点,但常发生假阳性错误。用与载体匹配的引物和目的的基因引物组合进行ＰＣＲ,可以消除假阳性,同时可以判断插入目的基因的方向。     

破伤风霉素C片段基因克隆,重组表达及免疫原性研究

应用ＰＣＲ技术从破伤风梭状芽孢杆菌ＤＮＡ中扩增出１．４ｋｂ ＤＮＡ基因,将其克隆到ｐＣＵ１８质粒中,经测序证明该ＤＮＡ片段为破伤风片段Ｃ的基因,并将此基因片段亚克隆到时ｐＧＥＸ－４５－２,构建成表达质粒ｐＧＥＸ－ＴＣ,在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行表达。     

昆虫杆状病毒衣壳主蛋白基因的PCR扩增,克隆和定位

用ＰＣＲ技术成功地扩增了苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的衣壳主蛋白基因（ｖｐ３９基因）,并克隆了该基因,利用纯的ｖｐ３９基因探针,在低严谨杂交条件下,已将粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ｖｐ３９基固定位在ＰｓｔＩ－Ｆ,ＢａｍＨＩ－Ｃ,ＥｃｏＲＩ－Ｃ,ＸｈｏＩ－Ｄ,Ｉ,ＥｃｏＲＶ－Ｈ,Ｘ等片段上。ＰＣＲ反应时,在扩增出预期的包括完整ｖｐ３９基因的１４０６ｂｐ片段的同时也扩增出一条Ｃａ．４００ｂｐ的片段,本文讨论了ＰＣＲ的特异性扩增和非特异性扩增。     

简并PCR法用于白色念珠菌MAPK新基因的筛选

ＭＡＰＫ很可能在白色念朱菌形态发生中起作用。根据所有ＭＡＰＫ保守区域ＶＩＢ和ＩＸ的氨基酸序列合成了两个简并的引物,以ＳＣ５３１４染色体ＤＮＡ作为模板,在非严谨条件下（３７℃）进行ＰＣＲ以筛选白色念球菌中新的ＭＡＰＫ基因,一共测定了１００个ＰＣＲ基因片段的序列,在２５个新基因片段中,筛选到两个新的ＭＡＰＫ基因片段,以这两个基因片段为控针从染色体基因库中克隆了对应的全长基因,序列分析表明它们是新的ＭＡ     

一种简单、快速、有效的PCR产物克隆方法

一种简单、快速、有效的ＰＣＲ产物克隆方法李红卫,涂长春,金扩世,章金刚（长春农牧大学兽医研究所,长春１３００６２）关键词ＰＣＲ,克隆我们实验室在用ＰＣＲ法扩增和克隆病毒ｃＤＮＡ片段过程中,摸索了一种既不需设计酶切位点,也不需要纯化ＰＣＲ产物及特殊载体...     

猪肥胖基因cDNA的克隆与分析

肥胖基因（ａｂ）是近年刚被克隆的新基因,该基因产物Ｌｅｐｔｉｎ是反映体内脂肪含量和调节体重的重信号因子,首次报道猪ｏｂ基因全长序列,并对不同种物ｏｂ基因的同源性进行了比较,以λＵｎｉ－ＺＡＰ＾ＴＭ为载体构建了猪脂肪ｃＤＮＡ文库,根据已知的人和鼠ｏｂ基因序列设计ＰＣＲ引物,利用ＰＣＲ法筛选猪脂肪ｃＤＮＡ文库,并用ＲＴ－ＰＣＲ从脂肪ＲＮＡ中扩增的３６６ｂｐ猪ｏｂ基因片段作探针,获得了全长３２７７ｂｐ的     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟…

以玉米黄化苗为材料,利用ＰＣＲ技术扩增了玉米１９ｋＤａ醇溶贮藏蛋白基因（ｚｅｉｎ）起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的－１￣－６９４片段具有１９ｋＤａ Ｚｅｉｎ启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达９０％以上。将启动子插入ｐＰＫＧＴ的ＧＵＳ基因及ＮＯＳ终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草,得到了转化植株。转化的烟草的ＰＣＲ扩增及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明目的片段已整合到     

抗水稻矮缩病毒的反义核酶及复制酶部分序列的合成,克隆及其水稻…

采用反转录－聚合酶链式反应方法（ＲＴ－ＰＣＲ）,在人工合成的引物引导下,扩增出水稻矮缩病毒基因组第一片段（Ｓ１）全长序列及第五片段的部分序列（Ｓ５Ⅲ）,将扩增的片段分别克隆到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）及ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位占上,并进行了序列测定,以此基础上,利用ＰＣＲ引入的方法将核酶序列引入到Ｓ５Ⅲ片段反义链上以构成反义核酶基因Ｓ５ⅢＲ,将Ｓ１片段５’端部分序列（Ｓ１－１）及Ｓ５ⅢＲ基因克隆的     

噬菌体6肽随机表面表达文库的构建

体外合成编码６肽的随机ＤＮＡ片段以及用于随机ＤＮＡ片段扩增了一对ＰＣＲ引物,再经ＰＣＲ扩增,ＢｇＩＩ酶切扩增产物,获得编码６肽的随机ＤＮＡ克隆片段,并利用已构建的噬菌体表面表达载体,经抗性和插入复活筛选,获得１．６×１０＾８个独立克隆,构成库的克隆经酶切,ＰＣＲ扩增,斑点杂交,序列测定,亲和素富集等方法的综合鉴定和评定,以及６肽随机克隆体外增殖和表达特性观察,结果均表明,我们成功构建了编码６肽的     

抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。