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1.
新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因序列分析 总被引:15,自引:0,他引:15
本研究报道了新城疫病毒(NDV)中国标准强毒株F48E8融合蛋白(F)基因的序列。该基因核苷酸序列长度为1700bp,编码由553个氨基酸组成的F0多肽。F0酶切激活部位序列为RRQRR↓F,具有NDV强毒的特征。F0中有3个主要由疏水性氨基酸组成的区域和6个可糖基化位点。经比较,NDVF48E8株和Miyadera株、TexasGB株的氨基酸同源性分别为93.64%和92.41%。 相似文献
2.
环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆 总被引:4,自引:0,他引:4
环状芽孢杆菌(Baciluscirculans)C2总DNA经PstI部分酶切后分离2~10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichiacoli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长30kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulansC2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。 相似文献
3.
对pGEX系列表达载体的多克隆位点(MCS)进行了改造,改造前MCS上仅有BamHI、SmaI和EcoRI三个酶切位点。改造后的MCS上含有8个酶切位点,它们分别是BamHI、SacI、AvaI、XhoI、BglⅡ、pstⅠ、KpnI和EcoRI,改造后构建形成的pGEX-L系列载体对目的基因的插入有更强的适应性。 相似文献
4.
在克隆和鉴定新城疫病毒(NDV)F48E8株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的基础上,应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175-1中启动子P7.5的下游,得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175-1。将此质粒pFGHN1175-1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3 ̄4h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化3次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV-HN基因特异 相似文献
5.
对含有麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶(mpt)基因的BamHI-BamHI8.0kb的DNA片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有21个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因(CarE)的2.4kb DNA片段为探针,经Southern blot分子杂交,将mpt定位于一个EcoRI-EcoRI-PstI3.0kb的DNA片段上,将该片段克隆至大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒载体pWHM3 相似文献
6.
限制性内切酶SCaI适用于多种质粒载体,尤其是融合蛋白表达载体,pGEX系统,因它具有二个SCaI酶切位点,因此用SCaI酶解图谱鉴定以pGEX系统为载体的重组子甚为便捷。简便碱裂解法提取重组DNA省时,省耗。本文探讨了SCaI对用常规和简便两种碱裂解法提取的重组DNA的酶解效率。结果表明:(1)简便碱裂解法抽提的重组DNA,用EcoRI、EcoRV、PstI、BamHI等限制性内切酶酶解,可以获 相似文献
7.
采用异硫氰酸胍(GuSCN)和硅藻从B95-8细胞中快速抽摸板DNA。根据EB病毒(EBV)B95-8株DNA全序列及编码EBV胸苷激酶(TK)的开放读框BXLF1的结构,设计合成一对引物,并在引物的5′一端分别引入EcoRI和PstI切点,用PCR技术扩增出一含完整的EBVTK基因的1.843KbDNA片段,NcoI酶切分析鉴定,EcoRI/PstI双酶切PCR产物和载体,使目的基因定向克隆至选 相似文献
8.
猪瘟病毒糖蛋白E0基因的克隆及及表达研究 总被引:2,自引:0,他引:2
用RT-PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株糖蛋白E0基因cDNA,并克隆到pGEM T载体中测定其核苷酸序列和推导出其对应氨基酸序列,结果表明这两个毒 间的E0基因核苷酸序列同源性为95.3%,氨基酸序列同源性为94%,有14个殖基的差异;与几个代表毒株ALD株、GPE株、Brescia株、Alfort株和国外测得的兔化弱毒C株相应序列进行比较,所测石门病毒核苷酸序列与上述 相似文献
9.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一 对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF 2全基因(702bp)。将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质 粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039 的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%~98. 6%和 92.3%~96.6%。重组质粒pTORF2经 Bam H I、Eco R V双酶切,回收ORF2基因,转 移入真 核表达载体pSecTag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2。此重组表 达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础。 相似文献
10.
马立克氏病病毒(MDV)814株B抗原基因的克隆及部分序列分析 总被引:6,自引:1,他引:6
提取感染鸡胚成纤维细胞MDV-I弱毒株814病毒DNA为模板,根据RBIB株gB基因5′及3′两端核苷酸离列设计引物,利用PCR技术扩增了我国MDV-I弱毒株814gB基因(2.9kb)将扩增片段平末端克隆到载体pBluescriptSK中EcoRV位点,经BamHI,HindIII酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与RBIB株gB基因无差异,显示了极高的 相似文献
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用鸭副粘病毒凤阳分离株WF01 D作9~10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF01 D病毒的F基因,获得了1条长约1.7kb的特异性条带。用PCR产物直接测序。测序结果表明,扩增片段大小为1782bp,含有1个1662bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明:WF01 D株与国内外其他NDVF基因的同源性为84.5%~97.0%,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为86.6%,说明WF01 D与国内外的传统毒株有较大变异。与Taiwan95株和J株的同源性为93.6%和97.0%,说明WF01 D与Taiwan95株和J株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117,表明为NDV的强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒F48E9株相比没有太大的变异。 相似文献
12.
NDV HeB02分离株的生物学特性及其F基因的克隆与序列测定 总被引:2,自引:0,他引:2
对河北省新城疫分离株HeB0 2的生物学特性进行了鉴定 ,根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列 ,设计了一对引物并以RT PCR特异性扩增出HeB0 2分离株的F基因 ,基因产物大小为 1 63kb ,与设计相符 ,对其进行序列测定后 ,与其它标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行同源性比较 ,结果表明 ,HeB0 2株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为 88 1 %、84 9%和 83 8%,由此可以看出HeB0 2分离株与标准毒株和疫苗株在F基因上发生了变异。 相似文献
13.
用鹅副粘病毒WF01G分离株进行9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF01G病毒的F基因,获得了1条长约1.7 kb的特异性条带。对PCR扩增产物测序。结果表明,扩增片段大小为1782 bp,含有1个1662 bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明:WF01G株与其他7株鹅副粘病毒的同源性为84.8%-98.8%,与国内外其他NDV F基因的同源性为84.7%-93.8%,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为86.8%,说明WF01G与国内外的传统毒株有较大变异。与Tai-wan95株的同源性为93.8%,说明WF01G与Taiwan95株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-G ln-Lys-Arg-Phe117,表明为副粘病毒强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒F48E9株相比没有太大的变异。 相似文献
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鹅副粘病毒SF02 F基因的序列分析及SF02的多重RT—PCR鉴别 总被引:8,自引:0,他引:8
对新近分离的鹅副粘病毒SF0 2采用RT PCR方法 ,扩增F基因后测序 ,得到全长的F基因。该基因的ORF总长为 16 6 2nt,编码 5 5 3个氨基酸 ,其裂解位点的序列为112 R R Q K R F117,与新城疫病毒强毒株的特征相符。其核苷酸和氨基酸同源性分析 ,并与国内新城疫病毒标准强毒株F4 8E9相比较 ,表明该毒株在F基因上已发生了较大的变异 ,而与近年来在我国台湾和部分西欧国家流行的禽副粘病毒有很高的亲缘关系。在分析F基因序列的基础上 ,设计 3条引物 ,建立了一种新的多重RT PCR方法 ,能区分鸡新城疫病毒与鹅副粘病毒。 相似文献
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4株鹅源新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及序列分析 总被引:12,自引:1,他引:12
测定了4株鹅源新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因5’端1700核苷酸片段的序列,并由此推导了F蛋白氨基酸序列,并对鹅源NDV的基因型分类地位进行探讨。结果表明,4株病毒F基因的同源性大于97%,与DNV标准强毒株F48E8 F基因的同源性为860%~868%,F基因转录起始序列及起始密码子位置与已知NDV完全相同;F蛋白具有和已知NDV相似的各种功能区,F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒株的特征。对F基因第334~1682位核苷酸之间3种限制性内切酶HinfⅠ、BstoⅠ\,\%Rsa\%Ⅰ酶切图谱的分析表明,4株病毒的基因型与文献报道的I~Ⅷ型有明显差异。 相似文献
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对于NDV不同基因型毒株的HN基因的氨基酸序列比较后发现,基因Ⅶ型的毒株在第65~75位的氨基酸序列较为保守,而其他各基因型在该区域则不尽相同。因此本文克隆了NDV基因Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ型的代表毒株La Sota、GX-2、F48E9的含有该区域的序列,并进行蛋白表达,通过特异性抗血清对表达肽段进行抗原性测定。应用表达的蛋白免疫SPF鸡,用ELISA检测各组的抗体水平。结果表明3个毒株在反应原性上存在差异。应用NDV F48E9强毒株攻毒,结果显示各多肽蛋白的保护率不同,表明在该区域这3个毒株之间存在着免疫原性差异。 相似文献
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DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系, 为了提高目的基因的表达量, 本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰, 对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子, 同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN, 剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F48E9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中, 将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、 pVC-HN, 用这些质粒转染293T细胞, 48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示, 与未经修饰的HN基因相比, 修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高, 并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。 相似文献
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DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系, 为了提高目的基因的表达量, 本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰, 对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子, 同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN, 剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F48E9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中, 将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、 pVC-HN, 用这些质粒转染293T细胞, 48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示, 与未经修饰的HN基因相比, 修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高, 并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。 相似文献
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NDV F48E9株与La Sota株F蛋白B细胞表位差异分析区段的鉴定和免疫原性比较 总被引:1,自引:0,他引:1
本文对预测的NDV F48E9强毒株和La Sota 疫苗株F蛋白优势表位进行比较分析。根据预测结果设计克隆了两个毒株F蛋白各4段表位区,分别将每个毒株的4段表位区连接到原核表达载体上进行了体外表达,鉴定得到4段多肽的大小分别是P1:8.0KD、P2:10.8KD、P5:13.5KD、P6:10.5KD。应用F48E9和LaSota特异性抗血清对表达各肽段进行了抗原性鉴定,P1、P2、P5、P6段均呈阳性反应,表明其中含有线性B细胞表位。其中F48E9 P5 (FP5)和La Sota P5(LP5)与血清反应时有明显差异。FP5和LP5与鸡IL-18成熟肽(m ChIL-18)蛋白以不同组合免疫SPF鸡,ELISA检测各组的免疫活性,结果发现FP5与m ChIL-18蛋白联合免疫组的抗体水平高于LP5与m ChIL-18蛋白联合免疫组、FP5、LP5单独免疫组;用NDV F48E9株攻毒结果显示FP5具有20%的保护率,说明P5段与F蛋白免疫原性相关,而LaSota P5不能抵抗强毒的攻击,证明该表位区域在两个毒株之间存在着免疫原性差异。 相似文献