第二十八期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存

采用Ficoll密度梯度离心 ,提取第 2 8期 (孵化 13 2h)性腺中的PGCs ,对其应用不同的冷冻保护剂和不同的平衡方法进行冷冻保存 ,并于复苏后进行体外培养。复苏后的PGCs用台盼蓝染色检测其存活率 ,结果发现 :从第 2 8期性腺中获取的PGCs在同一种冷冻保护液下 ,采用不同的平衡方法进行冷冻 ,对PGCs的存活率有显著影响 (P <0 .0 5 ) ;平衡方法相同 ,在不同冷冻保护液条件下 ,冷冻保护液III的冻存效果最好 ,与其他保护液之间存在显著 (P <0 .0 5 )或极显著 (P <0 .0 1)差异。冷冻保护液V和冷冻保护液VI二者对PGCs的冻存效果次之。冷冻保护液I、冷冻保护液II和冷冻保护液IV三者对PGCs的冻存效果最差。PGCs经体外培养 2 4小时后再进行冷冻保存 ,复苏后其存活率、体外培养存活时间均极 (P <0 .0 1)显著短于分离后直接冷冻的PGCs。     

鸡胚胎原始生殖细胞体外培养

以14-15期鸡胚血液为材料,采用Ficoll密度梯度离心方法,提取鸡胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),在无基质细胞和基质细胞上分别进行体外培养。从实验结果可以看出：在含有胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、鸡血清(chicken serum,CS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人胰岛素样生长因子(hIGF-1)、小鼠白血病抑制因子(mLIF)和青,链霉素双抗的M199培养液中培养时,鸡PGCs最多能够存活4天：当采用细胞因子和5天鸡胚胎性腺基质细胞共培养时能存活23代且每代细胞增殖可达近10倍。提纯后的PGCs细胞冻存复苏后,经台盼蓝染色鉴定存活率可达80％左右。     

不同时期鸡胚原始生殖细胞分离的研究

采用Ficoll密度梯度离心,酶解离两种方法在鸡胚孵化的第14期、19期、28期,分离、培养鸡胚中的原始生殖细胞(PGCs)。探索PGCs分离、培养的适宜时期及方法,以期获得较多数量,较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。结果表明：1．提取、分离PGCs的最佳时期依次为19期、28期。2．两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。但在19期和28期,酶解离法分离到的PGCs的相对数量较多,存活时间较长,是一种较适宜的分离方法。     

鸡胚胎原始生殖细胞的培养和传代

本文旨在探索鸡胚胎原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)培养、传代以及各种因素对PGCs培养的影响。实验结果表明,在添加10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、以及5ng/ml人干细胞生长因子(Humanstemcellfactor,hSCF)、10U/ml鼠白血病抑制因子(Mouseleukemiainhibitoryfactor,mLIF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(Fibroblastgrowthfactorbasic,bFGF)、0.04ng/ml人白细胞介素11(Humaninterleukin11,hIL11),10ng/ml胰岛素样生长因子(Humaninsulinlikegrowthfactor,hIGF)的高糖DMEM培养体系中,以多次离散法进行传代获得5-6代鸡胚胎PGCs,有效地维持了PGCs的未分化状态和正常二倍体核型,同时能够定向地诱导分化为神经细胞,具有作为多能性胚胎干细胞的特征     

鸡胚不同发育时期原始生殖细胞的分离方法

采用Ficoll密度梯度离心法和EDTA-胰酶酶解法两种方法,分别提取第14期(孵化53h)血液、第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)生殖腺中的PGCs,以比较两种分离方法对3个发育时期的鸡胚原始生殖细胞在相同体外培养条件下存活时间的差异。结果发现,两种分离方法均能分离到一定数量的原始生殖细胞,但是酶解法分离到的原始生殖细胞的相对数量较Ficoll密度梯度离心法的多,存活时间较长,是一种适宜的分离方法;对鸡胚发育第14、19、28期3个时期提取的原始生殖细胞进行体外培养,存活时间分别为：72h、88h和80h,三者之间差异显著。结果表明：在鸡胚孵化的第19期,因原始生殖细胞大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处,因而较容易收集,体外培养较为适宜,具有较强的可操作性[动物学报49(6)：835～842,2003]。     

从原始生殖细胞分离克隆鸡胚胎生殖细胞的研究

从孵化 5 5天的鸡胚生殖腺中分离得到大量原始生殖细胞 (PGCs)集落 ,这些集落的细胞经多次克隆传代具有胚胎生殖细胞 (EG)的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (传至第 9代 ) ,细胞集落有典型鸟巢状结构 ,PAS染色阳性 ,AKP染色阳性 ,在无饲养层无分化抑制因子LIF时可以自发分化成几种细胞类型 ,包括成纤维细胞、神经细胞、自律细胞等 ,悬浮培养时具有形成类胚体的能力。上述发现表明该细胞具EG细胞的诸多特性 ,为类EG细胞     

多氯联苯对鸡胚原始生殖细胞的损伤作用

目的：本实验研究了PCB以及雌二醇（E2）,睾酮（T）和雌激素受体阻断剂克罗米酚（clomiphen)对5日龄鸡胚性朱中原始生殖细胞（PGC）形态和数量的影响,并对胚胎性腺受损伤程度进行了评价。方法：在入孵前将PCB（Aroclor 1254)油剂注入海兰种蛋卵黄内,实验组中PCB的剂量分别为1,10,100ug/枚;E2和T油剂注射剂量均为10,100ug/枚;克罗米酚,克罗米酚和Aroclor 1254均为100ug/枚,体积均为100ul;对照组注射等量花生油,孵化温度为38度,相对湿度60％,孵化111－120h后取出胚胎进行全固定,经石蜡切片和高碘酸席夫试剂染色后观察性腺中的PGC。结果（1）与对照组相比,PCB延缓鸡胚发育,但是鸡胚死亡率与PCB的剂量不呈现剂量依赖关系,最大死亡率在PCB 1ug/枚组;（2）性腺中的PGC的数量随PCB注射剂量的升高而显著降低,而且左侧性腺比右侧性腺明显,在PCB 100ug/枚组的性腺中,PGC发生了空泡化和核固缩甚至成为空洞;（3）PCB可以导致鸡胚性腺中PGC的损伤程度显著加强;（4）E2,T和克罗米酚处理后,对性腺中的PGC没有显著影响;（5）注射PCB和克罗米酚后,对性腺中PGC的影响与Aroclor 100ug/枚组的结果相同,结论：PCB对鸡胚生殖的影响早在PGC定居性腺就开始了,且对PGC的影响只表现其毒性作用,并没有通过类性激素作用影响PGC的形态和数量。     

影响鸡原始生殖细胞分离克隆因素的研究(简报)

具有多向分化潜能的胚胎干细胞有两种来源:一是来自于早期胚胎内细胞团的胚胎干细胞(Em-bryonic Stem Cells,ESCs),另一种是来自于胚胎生殖腺原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EGCs)。     

细胞因子对鸡胚胎原始生殖细胞（EPGCs）增殖的影响

采用MTT法分别检测mLIF、bFGF、hSCF、hIL-11四种细胞因子协同作用对体外培养的第19、28期鸡EPGCs生长的影响。结果表明：与对照组相比较,19期的EPGCs体外培养72h后, mLIF、hSCF、bFGF、hIL-11对鸡EPGCs的增殖影响显著（P<0.05）。mLIF的最佳作用剂量是10~20ng/ml,hSCF的最佳作用剂量是15~20ng/ml,bFGF的最佳作用剂量是10～20ng/ml。hSCF、bFGF的联合使用优于单因子作用的结果（P<0.05）。单独使用hIL-11时,细胞的增殖情况比其他三因子单独使用的效果较差,但OD均值有随剂量增高而上升的趋势。在与其他因子联合使用的情况下, hIL-11的最佳作用剂量为0.10~0.20ng/ml。     

鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌和体的制备

探索了鸡胚12～17期血液中的原始生殖细胞(PGCs)迁移数量变化规律,将其在液氮中冷冻保存.并以Ficoll密度梯度离心、MiniMACS磁气分离、滤膜三种方法对PGCs进行分离,结果发现12～17期血液中均有PGCs存在,13期达到高峰约47.1±10.5个/μl,在血液中比例为0.0126%.冷冻保存3个月后解冻成活率达80%以上.三种分离方法所得的分离效果分别为95.7%、39.2%、63.0%,纯度为27.5%、8.4%、3.1%.将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至14～15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌和体,获得8只雏鸭(8/110).以鸡W染色体探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞,嵌和率达84.2%(16/19).表明鸡原始生殖细胞能够迁移定居到鸭胚性腺中,并有可能增殖分化成有功能的配子.     

Purification of Primordial Germ Cells from TNAPMouse Embryos Using FACS-gal

Tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP), the product of theAkp2locus, is expressed in mouse primordial germ cells (PGC) for an extensive period during embryogenesis. Mice with theAkp2^tm1Sormutant allele of TNAP expresslacZ(β-galactosidase; β-gal) under control of theAkp2locus. PGCs were purified fromAkp2^tm1Sorembryos using fluorescence activated cell sorting of β-gal expressing cells (FACS-gal). Analysis of the purified cells by alkaline phosphatase staining and immunocytochemistry with anti-c-kitantibody demonstrated that highly (98%) purified PGCs can be isolated using this method. This technique will facilitate experiments that require highly purified preparations of PGCs including cell culture and gene expression analyses.     

影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式,以高糖DMEM,添加0.1mM2-巯基乙醇,犊牛血清,细胞因子为培养基,以4-13周龄屠宰牛胎儿为实验材料,探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素,结果发现：当犊牛血清为15%时效果最好;细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著,而在传代过程中中有一定影响;以0.2%胰酶 0.04?TA为细胞消化液效果最佳;以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆牛胚胎干细胞,本研究观察到效果最好。     

Cells from Early Chick Embryos in Culture

Just prior to streak formation (Stage XIII) the two layered chick blastoderm is formed by the one layer epiblast which needs the influence of the hypoblastic layer to develop an embryonic axis. A study has been made of this latest possible stage in the development of the chick in which one cell population, the epiblast, is still totipotential. The intention being to examine in particular the differentiation capacities of these cells in culture and at the same time to compare them with hypoblastic cells. In studying differentiation we have attempted to minimize heterogeneity of the starting cell population by culturing either hypoblastic cells or epiblastic cells. The epiblastic cells were derived from epiblasts deprived of the marginal zone and of the area opaca. Hypoblastic cells formed a one cell thick characteristic epithelium. Epiblastic cells in culture were found to evolve from a homogenous sheet to clearly demarcated areas to dome structures which resemble embryoid bodies from teratocarcinomas. Histologically three main tissue types were found in the epiblastic cultures. Sometimes the borderline between two of the tissue types was found to be clearly demarcated by a basement membrane. Both hypoblastic and epiblastic cells produced a basement membrane-like structure when cultured in vitro. The appearance of mesoderm in the epiblastic cultures was particularly interesting and it was evident by the appearance of blood islands and clearly defined endothelial-lined cavities. No complex organized embryonic structures of any kind were found in the cultures.     

On the Origin of Primordial Germ Cells in the Chick Embryo

An attempt was made to re-examine the location of the primordial germ cells (PGCs) in very young chick embryos. Freshly laid blastoderms, prior to hypoblast formation, of a known anterio-posterior axis, were transversely bisected and each half was separately grown in vitro. Both anterior and posterior halves were shown to be fertile and each was shown to contain roughly the same amount of PGCs as a normal control embryo. It has been concluded that in the chick as well as in the duck there is no concentration of cells containing germinal plasm in the posterior part of the blastoderm.
Two other possibilities should be investigated:
1. A concentric arrangement of cells containing germinal plasm. 2. The absence of a germinal plasm and a relatively late appearance of PGCs as a result of induction.     

Appearance of Primordial Germ Cells in Young Chick Blastoderms Cultured in vitro

Appearance of primordial germ cells (PGCs) in young chick blastoderms was investigated by the cultivation of only the epiblast or hypoblast. Presumptive PGCs exist in the epiblast before primitive-streak formation. They translocate gradually to the lower layer during early stages of primitive-streak formation, though substantial number of presumptive PGCs remain in the upper layer. The existing primary hypoblast under the epiblast is dispensable for the further differentiation of the PGCs.     

蒙古绵羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

原始生殖细胞是用做分离和克隆胚胎干细胞的一种新的细胞资源。本研究将30-45日龄的蒙古绵羊胚胎生殖嵴及其临近组织用机械剪碎和胰蛋白酶+EDTA消化处理,添加DMEM（低糖）+10%FBS（犊牛血清）、38.0℃、5%CO2和饱和湿度条件下进行培养。其结果：未加任何细胞生长因子的情况下与其胎儿成纤维细胞共培养的方式也能分离得到类胚胎干细胞集落。这些集落细胞经多次克隆传代具有胚胎干细胞的诸多特征,如：具有连续传代的能力,细胞集落有典型鸟巢状结构,AKP染色呈阳性,核型分析结果染色体正常等。这些表明该细胞具有多能性,是绵羊类ES细胞。     

原始生殖细胞体外培养及应用研究

原始生殖细胞是来源于胚胎生殖嵴的一类具有多向分化潜能的干细胞,其形态、细胞表面标志、分化潜能均与来源于囊胚内细胞团的干细胞相似.在饲养细胞层和多种生长因子的共同作用下,可保持原生殖细胞在体外不断增殖而不分化,最终建立EG细胞系.本文就原始生殖细胞体外培养,建立EG细胞系及其应用前景作一综述.     

哺乳动物原始生殖细胞体内特化和体外培养

原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)是胚胎中最先出现的生殖细胞。PGCs来源于上胚层,最早出现在后肠,随后向生殖嵴迁移。这一过程伴随一系列复杂的分子调控机制,以及DNA甲基化重编程和组蛋白修饰等表观遗传过程。PGCs经过不断的分裂、发育及分化,最终形成配子。为了更好地研究PGCs发育与分化的调控和表观遗传过程,体外培养的研究变得越来越重要。本文以小鼠和人为例,介绍了哺乳动物PGCs的特化过程、PGCs特化过程中的表观遗传过程和PGCs的体外培养研究进展。