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本文报告了用完整酿酒酵母细胞及质粒DNA-起旋涡振荡转化酿酒酵母。以酿酒酵母Y162作为质NYEP24的受体菌.获得了20转化子/μg质粒DNA的转化率。旋涡振荡对质粒DNA有破坏作用,振荡时间对细胞存活率及转化率都有影响。酵母细胞的生长时期对转化率没有影响。本方法虽然转化率低,但简便快速经济。 相似文献
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电穿孔法转化完整酵母的研究 总被引:6,自引:0,他引:6
本文用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作材料,探讨了电穿孔转化完整酵母的几个条件。其中电场强度及脉冲时间是两个最重要的参数。在2kv/cm,9ms时获得10^4转化子/ugDNA的转化率。转化率还与所采用的菌株与质粒等条件有关。此技术简便迅速。 相似文献
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本研究使用电击法成功地将带有标记基因NPTⅡ的质粒pCaMVNEO转入欧白英的原生质体,并获得了再生转化植株。通过用pDW2质粒进行的CAT基因短暂表达研究,确定了欧白英原生质体转化的电击条件为:电容30nF、电场强度1500V/cm、时间衰变常数59.4微秒;质粒DNA浓度为20μg/2×10^6原生质体。在以上条件下,欧白英原生质体的相对转化率为12.4%,绝对转化率为2.4×10-4。在大多 相似文献
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酿酒酵母与球形红假单胞菌原生质体跨界融合研究 总被引:1,自引:0,他引:1
测定了球形红假单胞菌原核细胞与酿酒酵母真核细胞的原生质体形成、再生及融合最佳组合条件。以溶菌酶EDTA反应系统处理球形红假单胞菌P9479,最适脱壁条件为:溶菌酶浓度0.5mg/ml,EDTA浓度为0.2%,蔗糖浓度20%,酶作用时间为40min;此条件下原生质体形率为78.9%,再生率为11.2%。用蜗牛酶巯基乙醇反应系统处理酿酒酵母Y9407,最适脱壁条件为:蜗牛酶浓度1.0%,巯基乙醇浓度0.1%,蔗糖浓度20%,酶作用时间为30min;此条件下酵母原生质体形成率为99.8%,再生率为9.7%。用聚乙二醇诱导P9479与Y9407的原生质体发生融合,当聚乙二醇的浓度为30%,Ca2+浓度为50mmol/L,pH为6.5,时间为10min时,有最高的融合率为7.6×10-6。 相似文献
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用Bio-Rad生产的基因脉冲仪进行酿酒酵母电击转化实验,得到的最适条件为:5kv/cm25μF和200Ω。电击后涂布前的培养时间为2小时。电击后细胞存活率为46%时,每微克质粒DNA得到106以上的转化子。用相同的质粒和受体菌进行原生质体法和醋酸锂法比较实验,转化率分别为2×104和3.5×102个转化子/μgDNA。电击转化是最方便易行和高效率的方法。 相似文献
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黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母基因组中的整合及其在整合子中的稳… 总被引:2,自引:0,他引:2
把黑曲霉糖化酶cDNA连同酵母a因子启动子及其分泌序列,通过转化整合到酿酒酵母染色体DNA上,获得了整合型的分解淀粉酵母转化子。Southern印迹分析证明了糖化酶cDNA对酵母染色体DNA的整入。整合型转化子在以可溶性淀粉为碳源的培养基中分泌糖化酶活力达2.5u/ml,在非选择性培养基中连续转移10次,糖化酶分泌活力稳定不变。 相似文献
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确定了酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备的最佳条件。选取不同脱壁预处理时间及不同酶解时间,对酿酒酵母W5、休哈塔假丝酵母20335进行原生质体制备和再生,比较制备率和再生率。确定脱壁预处理30 min后,以终浓度2%的蜗牛酶,30℃、100 r/min酶解处理15 min为双亲株原生质体制备的最佳条件。利用原生质体融合的方法,以酿酒酵母W5和休哈塔假丝酵母20335为亲本株,构建可以利用木糖生产生物乙醇的新型酿酒酵母融合株,该前期工作为W5、20335原生质体融合工作奠定了重要的基础,对于将木质纤维素原料转化为生物乙醇的研究具有极其重要的意义。 相似文献
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酵母属间原生质体融合改进菌株木糖发酵性能 总被引:2,自引:0,他引:2
通过单倍体分离和紫外诱变,获得了14株树干毕赤酵母(Pichiastipitis)7124和酿酒酵母(Sacharomycescerevisiae)1300的营养缺陷型突变株。用聚乙二醇(PEG)和电诱导融合及致死融合等方法,实现了树干毕赤酵母和酿酒酵母的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生酒精,其厌氧发酵木糖和木糖葡萄糖混合液的能力明显优于亲株,耐酒精的性能也比亲株树干毕赤酵母7124有所提高。融合子经DNA含量、细胞体积测定和稳定性能实验证明为稳定融合子。 相似文献
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采用国产溶壁酶蛊酿酒酵母菌株X8的原生质体,将4×10^8/ml的原生持体悬浮液与等体积的1%低融点琼脂糖混匀后,凝固的原生质体包埋块在含1mg/ml蛋白酶K的NDS缓冲中处理24h,获得适宜于CHEFJ民泳的染色体DNA样品。采用了上述与前人不同的方法制备酿酒酵母染色体DNA样品,为广泛研究真菌电泳核型和制备巨型DNA分子量标记样品奠定了基础。CHEF电泳结果显示,供试菌株X8与对照菌755之间 相似文献
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用大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒pCZA168多次转化农抗120产生菌刺孢吸水链霉菌北京变种RF220的原生质体,均未得到转化子。来自吸水链霉菌应城变种10-22突变株的链霉菌质粒pIJ702可以转化RF220,但转化频率只有数十个转化子/μgDNA。用来自RF220本身的pIJ702对消除pIJ702后的RF220的原生质体进行了再转化,转化率没有明显的提高。用氨苄青霉素和甘氨酸协同处理RF220的菌 相似文献
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PEG/LiAc转化酵母细胞方法的改进 总被引:3,自引:0,他引:3
PEG/LiAc法转化酵母适用于酵母双杂交系统的大量筛选,并能获得10^6转化子/μg质粒以上的转化率,但如果没有进口的PEG3350而采用分子量接近的国产PEG4000进行转化的话,转化率仅为10^4,远低于文献报道的水平。我们报道了一个改进的PEG/LiAc方法,采用国产PEG6000,转化率也能达到10^6,且能将的热激时间从20min缩短为2min。 相似文献
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黑曲霉糖化酶cDNA的改造及其在酿酒酵母中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
应用PCR技术扩增黑曲霉糖化酶cDNA不含非编码区50bp的5’端740bp的序列与该cDNA3’端1400bp的序列连接,获得切除了5’端非编码的糖化酶cDNA。将改造后的cDNA插到质粒pMA91的酵母PGK基因的启动子和转录终止信号之间,构建了含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pMAG17。用原生质体转化法将重组质粒pMAG17引入酿酒酵母GRF18。酿酒酵母GRF18转化子在淀粉平板上产生水解透明圈,表明糖化酶已在酵母中表达并分泌至培养基中。测定转化子的胞外酶活力及淀粉水解率。结果表明:改造后的糖化酶基 相似文献
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耐温的克鲁维酵母(Y034)与产酒率高的酿酒酵母(A001)进行属间原生质体融合构建耐温酵母菌株,经DTT分段预处理获得大量具再生活性原生质体对融合株AY023等进行了乙醇脱氢酶同工酶,麦芽糖同化,遗传稳定性及高温发酵分析,融合株AY023表达了双亲遗传特性。在45℃高温发酵条件,乙醇产率高达7.4%,是目前已见文献报道的产酒率最高的耐温(45℃)酵母菌株 相似文献
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原生质体融合构建耐温酵母菌株 总被引:1,自引:0,他引:1
耐温的克鲁维酵母与产酒率高的酿酒酵母进行属间原生质体融合构建耐温酵母蓖株,经DTT分段预处理获得大量具再生活性原生质体对融合株AY023等进行了乙醇脱氢酶同工酶,麦芽糖同化,遗传稳定性及高温发酵分析,融合株AY023表达了双亲遗传特性,在45℃高温发酵条件,乙醇产率高达7.4%,是目前已见文献报道的产酒率最高的耐温酵母菌株。 相似文献
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以潮霉素抗性为选择标记的稻瘟病菌原生质体转化 总被引:2,自引:0,他引:2
稻瘟病菌对潮霉素(HygromycinB,简写为HmB)较为敏感,当不含无机盐的再生培养基中HmB浓度达到100μg/ml时,稻瘟病菌2539w原生质体的再生即被完全抑制。我们利用带有HmB抗性基因的质粒(pAN7-1),通过PEG②融合法对其原生质体进行转化,获得了HmB抗性转化子。转化子以两类形式出现:一类为大而生长稳定的菌落,另一类为小而生长不稳定的菌落,两类菌落产生频率分别为每μgDNA3-4个和10-20个。将大菌落转化子转接到含有HmB的新培养基上,仍可正常生长,但小菌落转化子却不能,说明前者为真正的转化子而后者为流产转化子。DNA杂交分析显示转化是由于质粒DNA整合到了2539w的染色体DNA上,整合可在染色体DNA的不同位点上发生。受试的7个转化子尽管各自的整合形式不同,但均在选择与非选择性培养中保持稳定。 相似文献
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酿酒酵母(Saccharomyces cereuisiae)基因启动子的分离和鉴定 总被引:4,自引:0,他引:4
肜动子探针载体pFR109从酿酒酵母总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖苷酶基因因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明:该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时它仍能动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去牛Y片段5端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。 相似文献
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用BamH1和CIP处理pCB20质粒,Sau3Al部分降解枯草杆菌抗阿霉素突变株染色体DNA,T4连接酶连接载体和DNA片断,构成表达文库。用这个文库分别转化枯草杆菌BD224菌株感受态细胞和原生质体。 相似文献