一种从酵母菌转化子中分离,检测重组质粒的有效方法

本文介绍了一种从酵母转化子中分离、检测重组质粒的有效方法。从小量酵母培养物提取的ＤＮＡ可有效地转化大肠杆菌,转化效率大约为３．７×１０５转化子／ｕｇＤＮＡ     

高效的酵母完整细胞转化法

以穿梭质粒PYES2转化酿酒酵母H158,用二硫苏糖醇（DTT）和处理酵母细胞,变性单链鱼精DNA（ssDNA）为质粒DNA的携带体;转化率比普通酵母完整细胞转化法提高200倍,可达8．3×104个转化子/μg质粒DNA。     

冻融法转化苜蓿中华根瘤菌

对于苜蓿中华根瘤菌转化方法的研究仅限于三亲杂交法和电激转化,本实验首次将冻融法用于转化苜蓿中华根瘤菌。将携带CUS片段并且含有壮观霉素抗性的质粒用冻融法转移至野生型苜蓿中华根瘤菌菌株,得到的抗性克隆用GUS引物进行PCR扩增鉴定。经过计算,冻融法的转化率为2．2×10^5／μg。与传统方法比较,冻融法操作简单,转化过程快速,转化率较高,所需时间较短,转化成本低,是适合用于苜蓿中华根瘤菌的转化方法。     

细菌巨大质粒的快速检测

本文报道了一种快速检测微生物巨大质粒的方法．该方法是通过对Ｅｃｋｈａｒｄｔ所报道的方法加以改进,使之能对根瘤菌、大肠杆菌、甚至链霉菌的大质粒进行快速检测．     

呼吸道感染肺炎克雷伯氏菌的质粒图谱分析

从临床住院病人痰及咽拭标本中分离出肺炎克雷伯氏菌９８株,占培养菌１０．６％。对该菌抽样做质粒图谱分析显示,患者主要为携带有三种即３２．７×１０６ｄａｌ、１×１０６ｄａｌ、０．５×１０６ｄａｌ质粒的肺炎克雷伯氏菌引起的。此方法简便,快速可靠,对进行病源菌流行病学调查有一定参考及实用价值。     

一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法

目的：从碱裂解法提取质粒DNA的原理．经过实验摸索获得一种快速、经济、结果可靠的菌液直接碱裂解电泳筛选重组子的方法。方法：不需提取质粒DNA．只需将细菌培养液碱裂解后直接进行普通琼脂糖凝胶电泳分析,就可以快速筛选出转化重组子。结果：结果和提取质粒酶切鉴定鉴定结果一致。结论：经实验证明菌液直接碱裂解电泳筛选重组子是一种快速、经济、可靠的方法。     

冷冻复苏法高效转化大肠杆菌

对传统的CaCl2方法进行的质粒转化做出改进,用冷冻复苏法使得CaCl2转化方法更加高效,整个过程仅需2min左右,同时分析了质粒快速转化的必需条件。     

优化噬热栖热菌的遗传转化体系

[目的]优化噬热栖热菌Thermus thermophilus的转化体系。[方法]将质粒DNA的形态、浓度及转化时间作为变量设计噬热栖热菌T.thermophilus的转化体系,以通过直接双交换同源重组法获取Δpyr E突变体的概率为依据判定转化效率。[结果]在转化时间为2 h,使用3.0μg/m L线性质粒DNA,获取表观Δpyr E的概率为3.44×10^-5;而使用同样浓度的超螺旋质粒DNA,该概率可达1.03×10^-3;说明超螺旋质粒的转化效率高于线状质粒。质粒DNA的使用浓度及转化反应时间对转化效率亦有影响,但并非完全成正相关。使用浓度为15μg/m L超螺旋质粒DNA,在转化时间为3 h时,获取表观Δpyr E的概率达到最大值(1.36×10^-2);超过该阈值,转化效率降低。[结论]在T.thermophilus中,通过优化转化体系将基因无痕敲除突变体获取概率提高到10^-2。     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

石英砂旋涡振荡处理转化酵母

本文报告了用完整酿酒酵母细胞及质粒ＤＮＡ－起旋涡振荡转化酿酒酵母。以酿酒酵母Ｙ１６２作为质ＮＹＥＰ２４的受体菌．获得了２０转化子／μｇ质粒ＤＮＡ的转化率。旋涡振荡对质粒ＤＮＡ有破坏作用,振荡时间对细胞存活率及转化率都有影响。酵母细胞的生长时期对转化率没有影响。本方法虽然转化率低,但简便快速经济。     

适用于野生型枯草芽孢杆菌转化有机溶剂方法的建立和优化

用经典的spizizen方法将穿梭质粒pLJ导入Bacillus subtilis168、Bacillus subtilisWB600、Baci／／ussubtihsW-B800中,均能达到70多个转化子／μgDNA的较高转化效率,但用此方法将该质粒导入由本实验室筛选并保存的野生型BacillussubtilisNx-2中,不能获得转化子。本研究对spizizen转化方法进行了改进。通过添加不同浓度的吐温-80,DMSO、丙酮、甲苯、乙醇等有机溶剂,均能获得转化子。同时,本研究对转化条件进行了优化,分别选取吐温-80、DMSO、甲苯等3种效果较好的添加剂设计正交实验。试验结果表明,在添加4％吐温-80、3％DMSO、1％甲苯的条件下得到了34个转化子／斗gDNA的较高转化效率。还研究了质粒与感受态共培养时间和感受态稀释倍数对转化的影响,当质粒与感受态共培养时间为3h,感受态稀释5倍时．转化效率较高。     

银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立

银耳（Tremella fuciformis）属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢．银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点．本研究以gpd—Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pG1g—gfp和pG1q—hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg／mL;采用电击法把pG1q—hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为：STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1．0×10^8个／mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2．0kV／cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个／μg DNA．采用最佳电击参数把质粒pG1g—gfP和pG1g—hph按1：1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37．5％．这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达．     

一种从重组质粒快速提纯DNA插入片段的方法

本文介绍一种从重组质粒中快速提纯ＤＮＡ插入片段的方法。质粒ＤＮＡ的制备简单、快速、分离的质粒ＤＮＡ可用于限制性酶切和转化大肠杆菌等。从琼脂糖凝胶中提纯ＤＮＡ插入片段的方法操作简单,回收效率高,提纯的ＤＮＡ片段可用于连接和制备杂交探针等。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

超广谱β-内酰胺类抗生素的耐药性与耐药质粒介导

目的：观察超广谱β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药质粒的关系,探讨耐药质粒在细菌之间传递的方式。方法：(1)配制耐药质粒提取试剂;(2)对LB细菌培养液进行耐药质粒的提取与检测;(3)对从12株ESBL细菌中提取的质粒进行质粒转化、质粒接合传递及药敏试验。结果：(1)此12株ESBL细菌中提取的耐药质粒进行电泳显示此质粒较大,约20．0kb。(2)质粒转化后,其转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类全部敏感。质粒结合传递体的耐药谱与以上相同。结论：β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药质粒介导密切相关,耐药质粒能把耐药基因传递给其他细菌,在细菌之间相互传递。     

HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母的研究

目的:实现HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母.方法:分别将乙肝病毒前S1蛋白和绿色荧光蛋白克隆到表达载体pPIC9K,获得重组质粒pPIC9K-EGFP-preS1,Sac1位点酶切线性化,采用醋酸锂(LiAc)和二硫苏糖醇(DDT)对巴斯德毕赤氏酵母Pichia Pastoris GS115预处理,在电压1.5 kv、电容25 F条件下进行电击转化.电击后立即迅速稀释在冰预冷的1 M的山梨醇中,混匀后取100 l的菌液均匀涂布YNBG平板,利用HIS4标记筛选转化子.结果:发现改进后的转化方法pPIC9K-EGFP-preS1的转化率提高到164×10 4个转化子/1μgpPIC9K-EGFP-preS1 DNA,是传统方法的6.6倍.结论:采用改进后的方法能有效的提高质粒pPIC9K-EGFP-preS1的转化率,为筛选高表达HBV PreS-EGFP融合蛋白的转化子打下基础.     

一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法

目的：建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。方法：用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒。结果：与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异。结论：建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。     

一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3～10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3～10min.同时探讨了Ca2 浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响     

Neurospora的一种新的、快速而有效的转化方法

叙述了一种新、快速、有效而可靠的转化Neurospora crassa的方法。本方法用醋酸锂处理萌发的分生孢子,再同DNA保温,然后用聚乙二醇(PEG)处理,然后短时间 热冲击,最后铺选择平板测定。报道了得到高转化率的最适条件。用环状和线状质粒DNA以及基因组DNA都可以得到转化。用相对不纯的DNA制备物如用快速微量制备方法得到的DNA也能进行转化,尽管转化率大大降低。这种转化方法简单而可靠,可大大节省时间和材料。     

一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴３～10 min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2 h减至3～10 min.同时探讨了Ca²⁺浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响.