桔小实蝇幼虫总蛋白双向电泳技术体系的建立和优化

【目的】建立和优化桔小实蝇幼虫Bactrocera dorsalis(Hendel)总蛋白的双向电泳条件。【方法】使用BPP法和3种TCA-丙酮法(TCA-丙酮-A法:直接加入裂解液磨样;TCA-丙酮-B法:样品提取液中加入40 mmol/L DTT;TCA-丙酮-C法:样品提取液中加入0.07%β-巯基乙醇)提取桔小实蝇幼虫总蛋白;使用13 cm和24 cm p H 4~7的IPG胶条分离桔小实蝇幼虫总蛋白;使用考马斯亮蓝法及硝酸银染色法对双向电泳凝胶进行染色;使用5800 MALDI-TOF-TOF MS/MS质谱分析仪对BPP法获得的特异蛋白进行质谱鉴定,并将检索数据库物种分别设为Metazoa(Animals)与Drosophila(Fruit flies)进行数据库检索。【结果】TCA-丙酮法中,TCA-丙酮-C法提取效果最好,BPP法优于所有TCA-丙酮法;使用考马斯亮蓝染色与硝酸银染色效果相当;使用24 cm胶条的蛋白分辨率明显高于13 cm胶条;检索数据库物种设为Metazoa(Animals)可获得比Drosophila(Fruit flies)更加全面的信息。【结论】使用24 cm p H 4~7的IPG胶条对BPP法提取的桔小实蝇幼虫总蛋白进行双向电泳,采用考马斯亮蓝法对双向电泳凝胶进行染色,可得到更好的双向电泳图谱,检索数据库时检索物种可优先设为Metazoa(Animals)。     

甘蔗叶片总蛋白提取及双向电泳条件的改进

针对甘蔗叶片中含有大量酚类和色素等干扰物质的现象．通过对甘蔗叶片蛋白样品制备、上样量和电泳条件等方面做了必要改进,建立了一套适用于甘蔗叶片蛋白质组分析的双向电泳（2-DE）方法。     

结核分枝杆菌菌体蛋白双向电泳技术的优化

目的：提取结核分枝杆菌菌体蛋白并建立一种利用双向电泳分离结核分枝杆菌蛋白质组的方法。方法：分离提取结核分枝杆菌菌体蛋白。样品采用不同pH梯度的鹏胶条进行第一向等电聚焦,12％SDS—PAGE凝胶进行二向电泳。银染后双向电泳图谱用Molecular Image Fx激光图像扫描仪扫描,PDQuest6．0软件完成配比分析。结果：优化了结核分枝杆菌菌体蛋白的提取方法,用裂解液8mol／L尿素结合2mol／L硫脲,140mmol／LDTT,0．5％biolyte,4％CHAPs,400mg／m1lOG处理,成功提取了蛋白,并通过结核分枝杆菌双向电泳技术体系的优化,建立了结核分枝杆菌菌体蛋白的分解图谱。pH4—7及pH7—10两胶面上共1387个点,占所检测到的蛋白总数的86％,绝大部分（1194个）蛋白位于pH4—7范围内。结论：为进一步开展结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究提供了方法学参考。     

卷柏总蛋白质提取方法及双向电泳条件的建立

目的:建立复苏植物——卷柏总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行阵列分离的双向电泳条件。方法:通过多种条件的组合与优化,建立了以物理和化学2种方法充分裂解植物组织细胞,并采用低温操作、加入PVP等去除植物组织中大量的酚类物质,最后离心去除不溶性杂质的卷柏蛋白质组双向电泳(2-DE)样品制备方法。第1向电泳为固相pH梯度等电聚焦,第2向电泳为垂直平板SDS-PAGE。结果:通过对样品制备、蛋白定量、第1向和第2向电泳、染色方法等各实验环节进行控制和优化,凝胶经考马斯亮蓝染色后,可分辨蛋白质斑点数约600个。结论:建立了卷柏总蛋白质的提取方法及蛋白质组双向电泳技术,为后续研究卷柏在干旱胁迫下的差异表达奠定了基础。     

口虾蛄性腺组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

旨在通过口虾蛄雄性、雌性性腺组织蛋白质双向电泳技术体系的优化,获得雄性、雌性口虾蛄性腺蛋白质的表达图谱。结果表明,不同的蛋白提取方法,上样前处理方法,上样量,聚焦时间及雌、雄性口虾蛄性腺蛋白表达图谱存在一定的差异。雌性、雄性口虾蛄用Tris-HCl提取后用丙酮沉淀方法提取蛋白质、不经上样缓冲液处理、上样量为10μg时,得到较好图谱。对图谱分析发现在pH4-6.5范围内,雌性口虾蛄性腺可溶性蛋白质种类多于雄性。雄性口虾蛄蛋白质点相对于雌性较少,且蛋白质大部分分布于酸性端。经过蛋白质双向电泳体系的优化,能显著提高双向电泳图谱的分辨率,为进一步研究口虾蛄性别差异表达蛋白的筛选,后续的口虾蛄蛋白质组学研究提供技术保障。     

玉米花丝蛋白质组双向电泳条件的优化

以玉米温敏自交不亲和系‘HE97’的花丝为材料,比较了3种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响,并对其中的蛋白质上样量、等电聚焦条件及SDS-PAGE凝胶浓度进行了探索与优化。结果表明,与酚提取法和改良的酚提取法相比,采用三氯乙酸/丙酮提取法提取蛋白质操作简便,所得的双向电泳图谱蛋白质点数较多,图谱背景清晰,是一种提取玉米花丝蛋白质的有效方法。优化后的双向电泳技术体系适合于玉米花丝全蛋白质的双向电泳分析。     

多子房小麦蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为建立适用于显性多子房小麦细胞质效应的蛋白质双向电泳体系,以显性多子房小麦材料DUOII与特异细胞质材料TeZhiI杂交的F1幼穗为材料,采用TCA-丙酮法提取蛋白质,并在IPG胶条长度和pH范围、SDS-PAGE凝胶浓度及蛋白质上样量等方面,对多子房小麦幼穗蛋白质双向电泳体系进行了探究与优化.结果表明,本文采用的蛋白质定量方法准确度高(R²=0.9999),确立了17 cm, pH4～7的IPG胶条, 12% SDS-PAGE分离胶,上样量为900 μg的双向电泳方法体系,获得了最适合本研究蛋白质组分析的双向电泳图谱. 经PDQuest 2DE 8.0.1软件分析,2-DE图谱上可分辨出1.444±14个清晰蛋白质点,且重复性较高(95%), 相关系数为0.960. 建立了一套适用于显性多子房小麦细胞质效应研究的蛋白质双向电泳体系.     

松材线虫全蛋白的提取及其双向电泳体系优化

目的:一种适用于双向电泳体系的松材线虫全蛋白提取方法的建立及其双向电泳体系的优化.方法:以松材线虫为实验材料,比较2种不同的蛋白提取方法,并对双向电泳中的IPG胶条长度、IPG胶条最适pH范围、上样量等3个方面的条件进行优化.结果:采用TCA-丙酮法提取的蛋白质浓度较高,达到2.18μg/μl.使用pH5 ～8、24cm的IPG干胶条,上样量为120μg,经双向电泳分离可得到背景清晰、分辨率较高的2 - DE图谱,能检测到2 000个左右清晰的蛋白点,含有相对丰富的蛋白信息量.结论:该实验所建立的松材线虫提取方法和优化体系可以为今后松材线虫蛋白质组学的研究奠定技术基础.     

酿酒酵母生物合成胞磷胆碱的条件优化

通过优化胞磷胆碱底物浓度的发酵条件,提高酿酒酵母发酵菌浓及胞磷胆碱转化率.分别以胞苷酸、磷酸胆碱、硫酸镁和乙醇等底物和反应关联物质诱导酿酒酵母,采用单因素变量实验优化发酵条件.优化后,酿酒酵母C401菌株摇瓶培养的菌浓为70 g/L,胞磷胆碱转化率为53.3％,比诱导前提高了33.5％.30 L发酵中菌浓可达90.5 g/L,胞磷胆碱转化率为59％.     

黄瓜子叶节的蛋白质组双向电泳条件的优化

对黄瓜离体子叶节的蛋白质双向电泳的条件进行优化的结果表明:黄瓜子叶节蛋白质主要分布在pH4～7范围,用酚抽提法制备蛋白质干粉,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(24 cm)的最适蛋白上样量为1 2001μg,第二向SDS-PAGE采用11.5%的分离胶,可以得到1100多个蛋白点.     

Shedding light on the role of Vitreoscilla hemoglobin on cellular catabolic regulation by proteomic analysis

Heterologous expression of Vitreoscilla hemoglobin (VHb) has been reported to improve cell growth, protein synthesis, metabolite productivity and nitric oxide detoxification. Although it has been proposed that such phenomenon is attributed to the enhancement of respiration and energy metabolism by facilitating oxygen delivery, the mechanism of VHb action remains to be elucidated. In the present study, changes of protein expression profile in Escherichia coli as a consequence of VHb production was investigated by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) in conjunction with peptide mass fingerprinting. Total protein extracts derived from cells expressing native green fluorescent protein (GFPuv) and chimeric VHbGFPuv grown in Luria-Bertani broth were prepared by sonic disintegration. One hundred microgram of proteins was individually electrophoresed in IEF-agarose rod gels followed by gradient SDS-PAGE gels. Protein spots were excised from the gels, digested to peptide fragments by trypsin, and analyzed using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. Results revealed that expression of VHbGFPuv caused an entire disappearance of tryptophanase as well as down-regulated proteins involved in various metabolic pathways, e.g. glycerol kinase, isocitrate dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, and D-glucose-D-galactose binding protein. Phenotypic assay of cellular indole production confirmed the differentially expressed tryptophanase enzymes in which cells expressing chimeric VHbGFP demonstrated a complete indole-negative reaction. Supplementation of delta-aminolevulinic acid (ALA) to the culture medium enhanced expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and glycerol kinase. Our findings herein shed light on the functional roles of VHb on cellular carbon and nitrogen consumptions as well as regulation of other metabolic pathway intermediates, possibly by autoregulation of the catabolite repressor regulons.     

红树植物秋茄叶片双向电泳技术体系的建立及优化

对适用于秋茄(Kandelia candel)叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术体系进行了优化.结果表明,采用酚抽提法提取的蛋白质浓度较低,约1.7 μg μL-1,SDS-PAGE电泳后几乎无条带;而采用改良TCA -丙酮沉淀法可显著提高提取液中蛋白质的含量,可达12.4 μgμL-1.秋茄叶片蛋白质主要分布在pH4～...     

柑橘叶片和果皮总蛋白质提取及双向电泳体系的建立

以春甜橘(Citrus reticulata Blanco‘Chuntianju’)果皮和叶片为材料,分别用Tris-HCl、尿素/硫脲(Thi/Urea)、三氯乙酸/丙酮(TCA)和酚(Phe)等4种方法提取柑橘总蛋白质,从蛋白质产量、单向SDS-PAGE和双向电泳等方面进行比较。结果表明,4种方法的分离效果存在较大差异,不论是以柑橘叶片还是果皮为材料,均以TCA法最好,且双向电泳图谱分辨率较好,蛋白点清晰、均匀、基本没有条纹,且蛋白点多。这说明TCA法不仅能很好地去除柑橘果皮、叶片中存在的大量干扰物质,而且还能得到稳定的蛋白点。     

A novel role for thioredoxin reductase in the iron metabolism of S. cerevisiae

Intracellular levels of iron are tightly regulated. Saccharomyces cerevisiae uses well-defined pathways to extract iron molecules from the environment. Once inside the cell, the iron molecules must be transferred to target sites via an intracellular iron transporter. Although analogous carriers have been described for other metals, such as copper, an iron transporter has yet to be identified. We used two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry techniques to attempt to identify the iron transporter from cytosolic fraction of S. cerevisiae. In this study, we identified the iron-binding activity of thioredoxin reductase, and our data suggest a potential role for this enzyme in intracellular iron transport.     

缺铁逆境胁迫下水稻叶片蛋白的双向电泳及其蛋白质组图谱分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导分别处理1、3、5天后,用酚法和TCA/丙酮法提取叶片中的可溶性蛋白进行双向电泳分析,从而研究在缺铁条件下叶片中蛋白表达的动态变化规律.结果显示1.不同pH IPG胶条分离蛋白的效果不同.用pH3-10的IPG胶条进行双向电泳,经考马斯亮蓝染色后,可在胶面上检测到大约450个蛋白点,其中约有89%的蛋白是酸性蛋白.如果用pH4-7的IPG胶条进行双向电泳,则可检测到大约600个蛋白点,其中有29个蛋白是上调表达,1个蛋白是下调表达,5个蛋白是诱导特异表达.2.不同方法提取的可溶性蛋白质量不同.TCA法简单易操作,似乎对于碱性蛋白的抽提效果更好,在2-DE图像上,减性端显示的蛋白点多;但此方法所得蛋白的再溶性差.酚法提取的蛋白再溶性好,所抽提的蛋白量较大,纯度较高.     

水牛精子蛋白质组双向电泳体系的建立和优化

建立和优化一种适合水牛精子蛋白质组学研究的双向电泳技术。以水牛精子为研究对象,比较两种不同配方的裂解液,以及不同上样量对其2-DE图谱质量的影响。结果显示,以7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、1%DTT、0.5%Cocktail of protease inhibitors为裂解液,24 cm胶条上样量200μg时,可获得较好的精子总蛋白质2-DE图谱。运用ImageMaster 2-Dplatinum分析软件检测出约500个蛋白质点,蛋白质大部分分布在等电点5-7之间,分子量范围约40-90 kD。     

花生叶片蛋白组对UV-B辐射增强的响应

为揭示UV-B辐射增强处理降低花生光合速率和花生抵御UV-B辐射增强的分子机制,应用蛋白质双向电泳与质谱联用技术对自然光环境下补增UV-B辐射(54μW/cm2)处理24h的苗期花生叶片差异表达蛋白质变化进行了分析。结果表明:补增UV-B处理下,花生叶片中共检测到丰度变化在2.5倍以上的差异表达蛋白点39个(其中22种蛋白质表达下调,17种表达上调),经过MALDI-TOF-TOF分析及数据库检索,成功鉴定出其中的27种蛋白质。被鉴定的27种蛋白质按其功能大致可归为8类,第Ⅰ类:光合作用相关的蛋白质,包括质体蓝素、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基、放氧复合物增强子蛋白1、PsbP结构域蛋白6和果糖二磷酸醛缩酶;第Ⅱ类:糖代谢相关蛋白质,包括苹果酸脱氢酶;第Ⅲ类:能量合成相关蛋白质,包括ATP合酶;第Ⅳ类:氨基酸代谢相关蛋白质,包括半胱氨酸合成酶;第Ⅴ类:蛋白质加工相关蛋白质,包括热激蛋白;第Ⅵ类:蛋白质翻译相关蛋白质,包括核糖体循环因子;第Ⅶ类:防御相关蛋白质,包括几丁质酶、过氧化物酶、Cu-Zn超氧化物歧化酶、二羟肉桂酸3-O-转甲基酶和类萌发素蛋白;第Ⅷ类,未知功能蛋白质。这些研究结果为进一步研究花生抵御UV-B辐射的分子机理提供了有意义的线索。     

小麦根蛋白提取与双向电泳方法的优化与应用

为了建立一套适合小麦根蛋白质组分析的双向电泳系统（2-DE）,得到更加清晰的电泳图谱,本研究以小麦幼苗根系为材料,对根蛋白的提取方法、上样量等进行了优化。研究发现,上样量为1200μg时,Trizol抽提法提取的蛋白能够获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,基本满足小麦根系蛋白质组学的分析和研究。     

华根霉固态与液态培养产胞外蛋白的比较蛋白质组学分析

【目的】考察固态和液态两种培养方式对丝状真菌华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021产胞外蛋白的影响,以加深对微生物固、液态培养特异性产酶的认识。【方法】利用成分相同的培养基对华根霉分别进行平板固态培养和液态培养,提取华根霉所产胞外蛋白,采用二维凝胶电泳(2-DE)结合质谱分析,分离鉴定差异蛋白。【结果】固态培养下华根霉所产胞外蛋白的蛋白酶活性是液态培养的9.2倍。胞外蛋白质组数据分析表明,华根霉固态和液态培养所产胞外蛋白存在显著差异,其中约70%是固态和液态培养下各自产生的特有蛋白。质谱鉴定进一步表明,固、液态培养对华根霉产胞外蛋白的种类和表达量都有显著影响,其中水解酶类所占比例较大,主要是与蛋白质降解相关的蛋白。【结论】固态和液态不同培养方式影响了华根霉产胞外蛋白的组成,有些基因只在特定培养方式下表达。固态培养下华根霉产胞外蛋白酶种类相对更多以及大部分蛋白酶的上调表达,可能是固态培养下胞外蛋白酶活性很高的原因。研究结果提示需要注意固液态不同培养方式下丝状真菌胞外酶的筛选和生产可能存在的不一致性。     

Sortin2 enhances endocytic trafficking towards the vacuole in Saccharomyces cerevisiae

Background

A highly regulated trafficking of cargo vesicles in eukaryotes performs protein delivery to a variety of cellular compartments of endomembrane system. The two main routes, the secretory and the endocytic pathways have pivotal functions in uni- and multi-cellular organisms. Protein delivery and targeting includes cargo recognition, vesicle formation and fusion. Developing new tools to modulate protein trafficking allows better understanding the endomembrane system mechanisms and their regulation. The compound Sortin2 has been described as a protein trafficking modulator affecting targeting of the vacuolar protein carboxypeptidase Y (CPY), triggering its secretion in Saccharomyces cerevisiae.

Results

A reverse chemical-genetics approach was used to identify key proteins for Sortin2 bioactivity. A genome-wide Sortin2 resistance screen revealed six yeast deletion mutants that do not secrete CPY when grown at Sortin2 condition where the parental strain does: met18, sla1, clc1, dfg10, dpl1 and yjl175w. Integrating mutant phenotype and gene ontology annotation of the corresponding genes and their interactome pointed towards a high representation of genes involved in the endocytic process. In wild type yeast endocytosis towards the vacuole was faster in presence of Sortin2, which further validates the data of the genome-wide screen. This effect of Sortin2 depends on structural features of the molecule, suggesting compound specificity. Sortin2 did not affect endocytic trafficking in Sortin2-resistant mutants, strongly suggesting that the Sortin2 effects on the secretory and endocytic pathways are linked.

Conclusions

Overall, the results reveal that Sortin2 enhances the endocytic transport pathway in Saccharomyces cerevisiae. This cellular effect is most likely at the level where secretory and endocytic pathways are merged. Them Sortin2 specificity over the endomembrane system places it as a powerful biological modulator for cell biology.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s40659-015-0032-9) contains supplementary material, which is available to authorized users.