可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA的制备

对可转化人工染色体(TAC)pYLTAC747NH/sacB文库载体DNA的制备条件进行了较系统的模索和研究.结果表明,该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后,可获得较纯净的载体DNA.对其闭环载体DNA分别用不同酶量的Hinid Ⅲ酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳Hind Ⅲ完全酶切条件为2 U Hind Ⅲ/μg闭环载体DNA、37℃酶切30 min;分别用0.5 MBU和1 MBU HK脱磷酶/μg对其线性载体DNA进行脱磷处理,经电泳和载体自连产物电转化检测表明其适宜的完全脱磷条件为1 MBU HK脱磷酶/μg线性载体DNA,30℃脱磷1 h;将所制备的线性载体DNA与λ DNA/Hind Ⅲ酶切片段进行连接,连接产物转化频率较高,其电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞频率可达到9.6×10s.     

人G6PD T279A和T279S两种突变子的体外构建

目的:构建葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)T279A和T279S两种突变子.方法:以Genbank No X03674为参考序列设计并合成引物、以含G6PD基因的质粒(Philip JMason博士惠赠)为模板,PCR扩增获得G6PD野生型基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物,连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD;酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段,连接、转化构建含G6PD野生型基因的重组质粒pAL-G6PD;设计并合成含有突变序列的引物,以pAL-G6PD为模板,体外扩增获得G6PD835-海口(835A→G,T279A)和835-中国-1(835 A→T,T279S)突变子.结果:酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒,EcoRI和Hind Ⅲ双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD,测序结果与参考序列完全一致.0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并定量pAL-G6PD单链DNA浓度约为200ng/uL.经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD的T279A和T279S两种突变子.结论:成功构建了G6PD的T279A和T279S两种突变子,为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础.     

利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物

目的：制备一套DNA分子量标准物。方法：利用多聚酶链式反应技术（PCR）,以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。结果：DNA分子量条带大小依次为1653bp、1173bp、691bp、606bp、496bp、401bp、326bp、238bp、155bp,条带分布适度、亮度清晰。结论：制备了能满足研究和实验室的要求DNA分子量标准物,和市售的相比,成本大大降低。     

脂肪嗜热芽孢杆菌质粒pFD101的限制性内切酶图谱

从脂肪嗜热芽孢杆菌T525中抽提得到的隐蔽性质粒pFD101,经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,确证为cccDNA。经测定,pFD101的分子量为3.83×10~6道尔顿。具有限制酶HindⅢ切点1个、SalⅠ和HpaⅡ切点各2个,没有EcoRI、BamHI和PstⅠ切点。根据限制酶片段的分子量作出了pFD101的简单酶切图。     

琼脂糖凝胶的合适浓度对于回收酶切后质粒载体的重要性

目的：探讨琼脂糖凝胶的不同浓度对回收不同大小的酶切后质粒载体纯度的影响。方法：将2种质粒载体酶切,并经不同浓度的琼脂糖凝胶电泳分析,通过比较酶切前和酶切后载体的相对位置,研究胶浓度对回收酶切后载体纯度的影响。结果：不同浓度的琼脂糖凝胶中,酶切前和酶切后载体的相对位置会发生变化,对能否成功回收到纯度高的酶切后DNA片段有重要影响;质粒大小不同,胶浓度的影响也不同。结论：合适的胶浓度对于回收酶切后质粒载体具有重要意义,应选择合适的胶浓度回收酶切后质粒载体。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。     

构建丝状真菌大片段基因组文库载体DNA的制备

载体DNA的制备是构建大片段基因组文库的关键步骤之一,高质量载体DNA受到酶切、脱磷等因素的影响,以载体pBHYG为材料,优化了限制性内切酶胁HindⅢ酶切和小牛肠碱性磷酸酶(CLAP)脱磷的作用条件,并在T4连接酶作用下自连,通过胶回收纯化制备了可用于进一步构建大片段基因组文库的线性载体DNA。     

武昌鱼肝线粒体DNA限制性内切酶酶解图谱与12SrRNA基因的初步定位

武昌鱼肝线粒体(mt)DNA经六种限制性内切酶BamHI,BgⅢ,BgⅡ,EcoRI,HindⅡHpall单酶完全酶解分別得到2,2,3,3,3和7个片段。用琼脂糖凝胶电泳测得各个酶解片段的长度和分子量,经计算该mtDNA长约16.6kb,分子量10.2×10~6道尔顿(dalton)。用七对限制酶双酶全酶解,构建出五种限制性内切酶图谱。以酵母线粒体15SrRNA基因为探针对武昌鱼肝mtDNA中的12SrRNA基因进行初步定位。     

嗜麦芽假单胞菌（P.maltophila）质粒的研究

本文用4种不同的方法对18株嗜麦芽假单胞菌是否含有质粒进行了检测,实验结果表明其中5株含有质粒。对其中的P2株不同生长期质粒存在状况的研究表明,该菌所含质粒与宿主不同生长期具有明显的相关性,其最高含量出现在稳定生长期,当细菌进入衰亡期时,其质粒量也随之减少,直至完全消失。 通过双向琼脂糖凝胶电泳、限制酶切分析以及分子量测定等方法,确定了嗜麦芽假单胞菌P2只含有1种质粒,分子量约为4.4×10~6道尔顿。有BamHⅠ、PitⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ单一酶切位点。该质粒可望进一步改建成十分有用的克隆载体。