猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSVORF7、PPVVP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法。应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和,或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52．3％;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26．9％。另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7．5％。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。     

安徽省猪圆环病毒2型毒株的分离与鉴定

目的从病原学角度了解安徽省猪群中PCV2的感染情况。方法PCR检测临床疑似PCV2感染的病料,阳性病料接种于PK15细胞中进行PCV2的分离和增殖,再经PCR检测、间接免疫荧光试验、电镜观察,以及ORF2基因序列分析等鉴定。结果9份临床病料中均扩增出630bp的PCV2特异性DNA片段,分离鉴定获得5株PCV2,分离毒株之间及其与27株国内外参考毒株之间的ORF2基因序列同源性在87.3%～99.8%。结论首次从病原学角度证实安徽省猪群中PCV2感染的普遍存在,分离毒株与国内外参考毒株的同源性均较高。     

猪圆环病毒2型的PCR检测方法应用

本研究登录Genbank对猪圆环病毒2型基因的序列进行分析,用Primer 5.0设计了ORF2基因的扩增引物,试图选择一种比较合理的PCR方法检查PCV2感染的病原,以期这种PCR方法可以有效分析猪综合征障碍病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒的扩增(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等比较常见的病原。研究结果表明,在PCV2进行扩增阳性样品检测中,发现一条异常447 bp的DNA条带,对产物测序结果进行扩增分析,证明其是PCV ORF2基因序列。敏感性检验分析表明检测样本DNA浓度时达到了9.8×10^-4ng/μL。PCR实验具有良好的稳定性和重复性。根据对66例临床病猪的分析表明,在PCV2的检测中阳性感染率是27.26%,这可能受到HCV、PRRSV、PRV、PPV等多种病毒的感染,其中混合感染的比例达到了72.23%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

安徽省猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

目的了解安徽地区猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)的感染状况。方法应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对采自安徽省14个地(市)的468份血清样品进行PCV2抗体检测,并运用PCR技术同步进行PCV2核酸检测。结果PCV2抗体检测的平均阳性率为74.36%,且阳性率随猪的日龄增长而升高,皖南地区的阳性检出率明显高于淮北和江淮两个地区,PCR与ELISA检测结果的符合率为99.37%。结论安徽省猪群中普遍存在PCV2的感染,病毒血症与抗体共存现象显著。     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

疫苗原辅料中猪圆环病毒1型、2型和猪细小病毒PCR检测方法的建立及验证

目的 建立疫苗原辅料中猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、2型(porcine circovirus type 2, PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法并进行验证。方法 根据NCBI公布的PCV1、PCV2和PPV基因序列设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立起检测疫苗原辅料中PCV1、PCV2和PPV的PCR检测方法,并对方法的重复性、中间精密度、专属性、耐用性和检测限进行了验证。结果 PCR反应的退火温度为55℃,特异性引物浓度为10μmol/L。该方法重复性、中间精密度、专属性和耐用性均良好,对PCV1、PCV2、PPV的最低检测限分别为1 pg/μL、100 fg/μL和10 fg/μL。结论 PCR检测方法可以有效检测出疫苗原辅料中外源病毒污染情况,能为生产合格的疫苗提供质量保证。     

猪传染性胸膜肺炎病料中PCV_2和PRRSV的PCR检测

应用PCR方法对从山东省不同地区采集的2 5 3份猪传染性胸膜肺炎肺脏和12 5份临床健康猪肺脏进行PCV_2和PRRSV的检测。结果显示,在传染性胸膜肺炎猪肺脏中,171份为PCV_2阳性,阳性率达6 7 5 % ;10 1份样品为PRRSV阳性,阳性率达4 0 % ;其中,6 8份样品同时检出PCV_2和PRRSV ,共感染阳性率达2 6 8%。而临床健康猪肺组织中,2 1份样品PCV_2检测结果为阳性,阳性率为16 8% ;12份样品PRRSV检测结果阳性,阳性率为9 6 % ,PCV_2和PRRSV共感染未检出。统计结果显示,传染性胸膜肺炎发病猪与临床健康猪PCV_2、PRRSV及PCV_2和PRRSV共感染的阳性率差异极显著,传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏中PCV_2和PRRSV的检出率明显高于临床健康猪。上述检测结果提示,猪传染性胸膜肺炎的发生可能与PCV_2和PRRSV的感染和共感染有关     

猪传染性胸膜肺炎病料中PCV_2和PRRSV的PCR检测

应用PCR方法对从山东省不同地区采集的253份猪传染性胸膜肺炎肺脏和125份临床健康猪肺脏进行PCV_2和PRRSV的检测。结果显示,在传染性胸膜肺炎猪肺脏中,171份为PCV_2阳性,阳性率达67.5％;101份样品为PRRSV阳性,阳性率达40%;其中,68份样品同时检出PCV_2和PRRSV,共感染阳性率达26.8%。而临床健康猪肺组织中,21份样品PCV_2检测结果为阳性,阳性率为16.8％;12份样品PRRSV检测结果阳性,阳性率为9.6％,PCV_2和PRRSV共感染未检出。统计结果显示,传染性胸膜肺炎发病猪与临床健康猪PCV_2、PRRSV及PCV_2和PRRSV共感染的阳性率差异极显著,传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏中PCV_2和PRRSV的检出率明显高于临床健康猪。上述检测结果提示,猪传染性胸膜肺炎的发生可能与PCV_2和PRRSV的感染和共感染有关。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立

设计合成了一套引物和TaqMan探针,特异性扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,在国内首次建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法,且该方法具有较好的特异性和重复性,对PCV2DNA检测下限为1copy/μL,敏感性比常规PCR高106倍;分别用该法和普通PCR方法对PMWS人工发病猪的10份组织及30份血清样品检测,结果表明该方法具有更快速、灵敏、准确、低污染等优点,并可以对PMWS的早期检测、预防起到指示作用.     

猪肝细胞和培养上清液中猪内源性逆转录病毒的检测

建立了猪肝细胞及其培养上清液中猪内源性逆转录病毒(PERV)的检测方法,探讨了其在猪肝细胞生物人工肝应用中的意义。以PERV gag基因为靶序列,选用特定的引物,PCR检测中国实验用小型猪肝细胞PERV前病毒DNA;RT-PCR检测猪、犬、大鼠以及HBV阳性病人血清和猪肝细胞培养6h、24h时的上清液PERV RNA,同时检测猪肝细胞猪线粒体DNA(mtDNA)。研究结果表明：检测5份中国实验用小型猪血清、肝细胞及培养猪肝细胞24h时的上清液PERV均为阳性,而5份培养猪肝细胞6h时的上清液、5份犬血清、5份大鼠血清和5份HBV阳性病人血清PERV检测结果均为阴性,猪肝细胞中均可检测到猪mtDNA。因此,中国实验用小型猪肝细胞携带PERV;PERV可释放到血清中;猪肝细胞培养24h后该病毒颗粒已释放到培养液中;PCR和RT-PCR方法检测PERV具有特异性强、简便的特点。     

猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速检测

According to the published genome sequences of Porcine circovirus type 2(PCV2)and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),primers were designed and PCR,RT-PCR were set up for the detection of PCV2 and PRRSV,respectively,With the established methods,38 clinical samples from the respiratory disease pigs were detected for the presence of PCV2 and PRRSV. The results demonstrated that 22 samples were positive for PCV2,27 samples were positive for PRRSV and among the above positive samples,18 samples were positive for both viruses,The data obtained in the present study indicated that PCV2 and PRRSV maybe play an important role in the course of the development of respiratiory diseases.     

猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速检测

呼吸道疾病是猪场最常见的疾病之一,严重影响猪群的健康,已经给世界养猪业造成了巨大的经济损失[1,2].呼吸道疾病的病原复杂多变,不同的猪场病因可能完全不同,从而给疾病的诊断与防治带来了很大的困难.多年的研究表明,呼吸道疾病的病因可能包括猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪流感病毒、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MH)、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus, PCV2)及猪链球菌或沙门氏菌等[3～8].其中PRRSV与PCV2为近几年新发现的猪重要的传染性病原,且呈不断的蔓延趋势,在呼吸道疾病发生过程中所起的作用日益增强[9,10].     

Porcine Salmonellosis

Renal vascular lesions associated with experimentally induced septicemic porcine salmonellosis consisted of fibrinoid necrosis of the vessel walls and fibrin thrombi within the lumina of interlobular arteries, afferent arterioles and glomerular capillary loops. Extrarenal vascular alterations were predominantly localized to the skin and the lungs. In these sites, too, mere fibrin thrombi were found in the capillaries, whereas mixed thrombi, consisting of fibrin, platelets, leucocytes and erythrocytes were present in larger vessels. The conclusion is drawn that the renal vascular injury is completely compatible to the generalized Shwartzman reaction, while the extrarenal vascular changes may only in part depend on this mechanism.     

猪C1q的分离纯化与鉴定

猪Ｃ１ｑ由猪血清通过ＰＥＧ沉淀优球蛋白、低离子强度透析沉淀、ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４８亲和层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００凝胶层析等步骤分离纯化,每３００ｍｌ血清可制得９．８ｍｇＣ１ｑ,产率为４６．７％。纯化的猪Ｃ１ｑ在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上显示出三条染色带,分别在２９、２６、２２ｋＤ处,薄层扫描结果表明纯度达９１％;纯化的Ｃ１ｑ保持了较高活性,终浓度为４μｇ／ｍｌ时仍可使致敏的绵羊红细胞出现明显的凝集现象。猪Ｃ１ｑ－ＥＬＩＳＡ结果表明,动物Ｃ１ｑ代替人Ｃ１ｑ应用于临床检测是可行的。