木瓜蛋白酶的研究 Ⅳ.活性中心组氨酸残基的羧甲基化

(1)在过量半胱氨酸存在下微量溴代乙酸或碘代乙酸在pH5对木瓜蛋白酶有強烈的抑制作用,当抑制剂与酶的克分子比为0.5时,抑制即达完全。抑制前后木瓜蛋白酶巯基含量不变。溴代乙酸作用后所得到的羧甲基木瓜蛋白酶汞盐結晶,与木瓜蛋白酶汞盐結晶相同。(2)在6M尿素溶液中溴代乙酸与木瓜蛋白酶的作用速度显著降低,底物L-白氨酰胺及抑制剂对氯汞苯甲酸都具有保护作用。这些事实表明溴代乙酸的抑制与木瓜蛋白酶的催化活性有密切关系,其作用点很可能是活性中心所在。(3)以双相电泳层析进行氨基酸組成分析結果指出,溴代乙酸作用点很可能是組氨酸殘基。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅱ.酶蛋白中巯基,咪唑基与酶活力的关系

(1)酰化酶能被各种巯基試剂所抑制,其中以PCMB的抑制最为明显,在所有的抑制情况下,都保留有一定的剩余酶活力。巯基乙酸能完全解除PCMB的抑制,恢复程度随所加的浓度而定,当巯基乙酸过量子抑制剂150倍时,酶活力反而高于原始活力20%,若浓度再高,酶活力又重新下降。(2)酰化酶經光氧化后活力就迅速丧失,但加对色氨酸殘基专一的試剂N-溴代琥珀酰亚胺并不影响酶的活力。溴代乙酸在較高浓度下亦能抑制酶的活力,抑制程度在作用pH为5左右时較为明显。(3)pH不影响酰化酶与底物結合的米氏常数K_M,而影响最大反应速度V。从pH对V影响的作图中求出活性基团的pK值为5.9和8.6,分別相当于酶蛋白中組氨酸和半胱氨酸的解离常数。(4)从实驗結果中推測,組氨酸和半胱氨酸是酰化酶的必需基团,它們可能与酶中金属离子以配位价的形式結合而共同构成一活性中心,在酶催化反应吋底物先通过金属离子与酶相結合,然后再进一步被催化。     

两种单羧甲基组氨酸异构体的结构

核糖核酸酶在pH5.5时能被溴代乙酸或碘代乙酸抑制,并从失活的酶的水解物中分离出单羧甲基组氨酸,因而便提供了粗氨酸残基参与了该酶的活性中心的一个直接证据。Gundlach等并且报导,从失活的酶的全水解物中所分离出的单羧甲基组氨酸只符合于从N~α-乙酰组氨酸经羧甲基化再经     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅵ.白氨酰胺的聚合作用

木瓜蛋白酶于pH7在半胱氨酸存在下能催化白氨酰胺生成聚白氨酸,聚合物分子量約为1,200,过程中只有聚合作用并无白氨酰胺的水解。当反应系統中同时有苯丙氨酸甲酯存在时則生成白氨酸与苯丙氨酸之比为1∶1的,分子量約为1,400的共聚物。虽然从酶制剂的均一性,离子交換柱层析时活力的平行分布以及溴代乙酸的抑制看来,轉酰基反应和水解反应一样都是由木瓜蛋白酶所催化的,但根据白氨酰胺与苯甲酰精氨酰胺同时存在时的总反应速度为二者在相同条件下分別作用速度之和,催化白氨酰胺聚合的pK_b为5.3与苯甲酰精氨酰胺水解的pK_b值(3.3)显著不同,以及N-溴代琥珀酰亚胺对水解和聚合作用的影响也不相同等看来,木瓜蛋白酶催化水解与聚合作用的活性中心很可能不完全相同。     

对硝基苯氨甲酰甲基溴对甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抑制

甘油醛-3-磷酸:NAD氧还酶(甘油醛-3-磷酸脱氢酶,酶学委员会编号1.2.1.12)是一个典型需要巯基的酶。许多巯基试剂如碘代乙酸或对氯汞苯甲酸等皆能完全抑制酶的活力。近年来一些作者曾利用标记的碘代乙酸研究了酶和抑制剂的结合当量。我们发现对硝基苯氨甲酰甲基溴(以下简     

木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶的研究——ⅥⅠ.无花果蛋白酶对不同底物的作用

观察无花果蛋白酶对一些合成底物作用的结果,说明酶的专一性和木瓜蛋白酶相似。它的特点是在pH7.4对白-NH_2的作用速度此对Bz-精-NH_2水解速度还快,并且在一定条件下只有白-NH_2的聚合反应而无供体的水解。酶作用于白-NH_2及Bz-精-NH_2共同存在时的反应速度也和木瓜蛋白酶相似,为在相同条件下分别作用于二者的速度之和。但从对氯汞苯甲酸和溴代乙酸的抑制看来,这两种活力是由同一酶所催化,可能酶对于二种反应的活性中心不完全相同。     

醛縮酶的研究——I.底物对醛縮酶被胰蛋白酶消化时的保护作用

(一)天然醛縮酶受胰蛋白酶消化迅速失活,但底物的存在有明显的保护作用。在实驗的条件下,如有底物的存在,醛縮酶被胰蛋白酶消化20分钟时就釋放出三个肽段(舍27个氨基酸殘基)保留約原活力的60％,而无底物保护的酶則完全失活。 (二)在底物存在下,醛縮酶受胰蛋白酶消化得到的殘余酶蛋白基本上是均一的,具有和天然醛縮酶若干相似的性质。 (三)在底物保护下,醛縮酶受胰蛋白酶消化釋放肽的位置可能在醛縮酶B鏈的N端部分。 (四)底物的可能保护机制是FDP与酶形成相对稳定的酶-底物絡合物,FDP的6-磷酸部分与酶蛋白肽鏈C端酪氨酸或其附近的某个基团相連,二羥丙酮磷酸部分的磷酸則与活性中心賴氨酸附近的氨基酸相結合,使賴氨酸的ε-氨基处于易与底物的酮基結合形成Schiff碱的地位。 (五)磷酸緩冲液也具有对抗胰蛋白酶消化醛縮酶的保护作用,但其机制可能与FDP不同。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅰ.金属离子与酶活力的关系

(1)大多数金属絡合剂除EDTA和迭氮化鈉外都能抑制酰化酶的活力,在可逆抑制情况下加入不同金属离子能部分或全部恢复酶活力。在固定絡合剂的浓度下酶活力的恢复程度与所加的金属离子浓度有关,每一金属离子都有一最适浓度。从以上結果推测酰化酶中的金属离子可能是Co~( )或Mn~( )离子。(2)在温和的条件下并有底物存在时,邻二氮菲和巯基乙酸对酰化酶的抑制是属于竞爭性,K_i值分別为1.28×10~(-4)M和1.74×10~(-3)M;一分子酶是与二分子抑制剂相結合。推測酰化酶可能是以二聚体形式存在。当抑制剂的浓度增大或使反应温度升高时都将引起不可逆的抑制。若酶与抑制剂預先一起保温亦得到类似的結果。(3)用电透析或在不同pH緩冲液下透析以除去酰化酶中的金属离子,都将导致酶的不可逆失活,因此酶中金属离子除起与底物結合的作用外,尚与維持蛋白貭的构型有关。     

牛脾酶制剂催化从白氨酰胺生成聚白氨酸的作用

(1)牛脾酶制剂于pH 7.8及半胱氨酸存在下,具有明显的催化从白氨酰胺生成聚白氨酸的作用。聚合物約含13～15个白氨酸。(2)根据溴代乙酸的抑制,不同底物的共同作用,以及温度的影响,看来上述反应和组織蛋白酶A,B,C等无关,可能是由一个新的酶所催化。     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅰ.比较家蚕和野蚕各种氨基酸和α-酮戊二酸之转氨作用并自蓖麻蚕丝腺体中提取支链氨基酸-谷氨酸转氨酶及其一些性质的研究

(1)比較家蚕(华九-云瀚)和野蚕(蓖麻蚕、柞蚕和樗蚕)各种氨基酸和α-酮戊二酸之轉氨作用;发現在家蚕和野蚕絲腺体后部及脂肪体中都存在有活力強的谷丙轉氨酶和谷天轉氨酶。(2)在野蚕(萞麻蚕、柞蚕和樗蚕)之絲腺体后部存在有支鏈氨基酸((?)白氨酸、白氨酸和缬氨酸)和α-酮戊二酸及丙酮酸之間的轉氨作用。闡明了絲腺体中丙氨酸生物合成之另一途径。(3)在家蚕及野蚕之体液中,和Koide之結果不同,存在有谷天轉氨酶及谷丙轉氨酶。比較了五龄不同日期以上两酶和支链氨基酸-谷氨酸轉氨酶活力之变化。(4)証明了支鏈氨基酸和α-酮戊二酸之間的轉氨作用是酶促的轉氨反应,而非由氨基酸供体之脫氨作用,继而和α-酮戊二酸之加氨作用而形成谷氨酸。(5)自萞麻蚕絲腺体提取支鏈氨基酸-谷氨酸轉氨酶。和原始之活力相比提高了比活39倍,回收率为81%。(6)支鏈氨基酸-谷氨酸轉氨酶在α-酮戊二酸浓度較低时随浓度之增加而上升,到一定浓度时,反应速度反而下降。(?)白氨酸和α-酮戊二酸之間的轉氨作用,在1小时之內,谷氨酸之形成速度基本上呈直线关系。对热不稳定,在50℃时活力降低82%。(7)巯基抑制剂对支鏈氨基酸-谷氨酸轉氨酶具有显著的抑制作用。PCMB(10~(-4)M)抑制該酶60%,溴化乙酰胺(10~(-4)M)为37%;DL-环絲氨酸对該轉氨酶之抑制作用指出,該酶是属于对环絲氨酸具有低度敏感性的轉氨酶类。     

硫硫键的分光光度法测定

本文主要介紹用分光光度計直接和間接測定硫硫鍵的二个方法。由Na_2SO_3和硫硫鍵反应而产生的巯基可以和对氯汞苯甲酸(PCMB)結合而引起紫外吸收增加。这是一个定量反应,从紫外吸收增加数值可以算出硫硫鍵的含量;为了避免其他紫外吸收物貭的干扰,也可以利用含有二苯硫代縮二氨基脲(双硫腙)的四氯化碳溶液抽提殘留的自由PCMB,从PCMB与双硫腙結合而引起有机相可見光(625mμ)吸收的減少而間接求得硫硫鍵的含量。Na_2SO_3能和PCMB可逆地生成具有紫外吸收特征的絡合物,在pH为9.6,温度为50度时,这一反应的平衡常数为6.7mM,但当Na_2SO_3浓度远較PCMB为过量时,这一反应并不影响用上述方法对硫硫鍵測定的准确性。也可以在反应完成后用加入較Na_2SO_3略为过量的H_2O_2消除这一絡合物对紫外光吸收的干扰。依靠紫外吸收的测定方法比較准确,測定誤差可在2%以內,而用双硫腙間接測定誤差約在5%左右。用上述二个方法对一些蛋白如胰島素、木瓜蛋白酶、核糖核酸酶、胰疑乳蛋白酶、胰蛋白酶、人血清白蛋白等蛋白貭的硫硫鍵及巯基进行測定的結果与文献上报告符合。此外,在改变測定条件时还清楚地观察到不同蛋白貭的硫硫鍵,甚至同一蛋白貭內不同硫硫鍵与Na_2SO_3反应的能力相差很远。例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的硫硫鍵較易反应,胰島素較难,而核糖核酸酶和木瓜蛋白酶分子中的某些硫硫鍵則要求更为強烈的反应条件。     

盐浓度、三磷酸腺苷、pH、醇和脲对刚果红与甘油抽提的骨骼肌肌纤维结合的影响

本文报告一些外界条件对剛果紅与甘油抽提的骨骼肌肌纤維結合的影响。所用方法大体上可以分为两类:(1)将肌纤維束浸于不同的剛果紅溶液中,观察染色的速率和深度有何差別;(2)将已經染色的肌纤維束浸于其他成分和用来染色的剛果紅溶液相同,但是不含剛果紅的洗脫液中,过一定时間后改变洗脫液的成分,观察由此所引起的洗脫速率的变化。得到的結果主要如下: (一)在一定范圍內增加盐濃度能促进剛果紅和肌纤維的結合,也能减低剛果紅从已經染色的肌纤維洗脫的速率,甚至使已被洗脫的剛果紅又重新和肌纤維結合。 (二)在洗脫液不含盐或含盐較少的情况下,三磷酸腺苷的作用和其它盐类的相仿,可是在洗脫液盐濃度較高的情况下,它却能增加洗脫的速率。 (三)两类实驗結果都表示硷性溶液(pH 9—10)不利于剛果紅和肌纤維結合,而且在硷性剛果紅溶液中染色的肌纤維或已經染色的肌纤維用硷性溶液处理后都基本上不出現二向色性。 (四)甲醇和乙醇能可逆地阻止剛果紅和肌纤維結合。 (五)脲能增加剛果紅从已經染色的肌纤維中洗脫的速率。文中还討論了剛果紅分子和收縮蛋白分子結合方式的問題,认为盐鍵和氫鍵大概都在起作用,而且在肌纤維中排列有規則的一部分剛果紅分子可能是通过氫鍵和收縮蛋白分子結合的。     

功能化离子液体化学修饰猪胰脂肪酶的催化性能

选取氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、氯化1-羧甲基-3-乙基咪唑、氯化1-羧甲基-3-丁基咪唑3种离子液体对猪胰脂肪酶(PPL)进行化学修饰,得到3种修饰的脂肪酶分别命名为PPL-M、PPL-E、PPL-B。以三乙酸甘油酯水解为模型反应,考察离子液体修饰前后PPL的活力、热稳定性、耐有机溶剂性等酶学性质,并通过紫外光谱研究修饰对PPL空间结构的影响。结果表明:修饰后PPL的活力明显提高,对温度和pH的敏感度降低。修饰酶的热稳定性明显提高,在高浓度的甲醇及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中仍能保持游离酶活力的100%。修饰后酶的特征吸收峰发生红移,吸收强度增强,修饰后酶的微环境发生了改变。     

日本血吸虫精氨酸酶的研究

从人工感染的豚鼠中取得日本血吸虫,制成匀浆后在37℃与pH9.0,0.1M的L-精氨酸作用10分钟,用呫吨氫醇法测定生成的脲量,以求得精氨酸酶的活力,結果用微克分子脲/毫克氮/小时表示。虫龄31—54天的各批血吸虫間酶活力无显著差別,平均值雄虫为58.0±3.6,雌虫为67.2±18.3,合抱虫为55.6±10.7。血吸虫精氨酸酶的最适pH为9.0,但在pH8.7—9.5之間測定的結果差別不大。底物L-精氨酸的最后濃度为0.09M时,酶活力已达最高值;濃度再升高直至O.3M/时,活力維持在同一水平。錳离子和鈷离子能激活血吸虫的精氨酸酶,假使先将这两种离子与匀浆預温30分钟,可使激活作用明显增强。賴氨酸、白氨酸和南瓜子氨酸对血吸虫的精氨酸酶均有抑制作用。治疗血吸虫病新药F-30066对此酶的抑制强度因药物的水溶液曾否見光而异,光照过的F-30066溶液作用較强,在2×10~(-5)M的濃度下可抑制40%。酒石酸銻鉀在10~(-4)M/时对酶活力无影响。血吸虫体內的脲含量平均为1.4微克/毫克氮,用一般的方法于50—250对血吸虫中未能測出有脲酶的存在。     

链霉素生物合成中胍基来源的证明

在鏈霉菌的发酵中,加入精氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸,有促进鏈霉素合成的作用。应用同位素C~(14)O_2做試驗,証明鏈霉菌細胞能固定C~(14)O_2于鏈霉胍胍基的碳原子上,鳥氨酸促进C~(14)O_2的参入,但精氨酸却呈冲淡C~(14)O_2参入的作用。鏈霉菌細胞悬液与鳥氨酸和C~(14)O_2保温,产生C~(14)-精氨酸。C~(14)-精氨酸經精氨酸酶作用,分解为鳥氨酸,后者沒有放射性活力,說明仅精氨酸的胍基的碳原子是标記的。鏈霉菌細胞抽出液中有鳥氨酸轉氨基甲酰酶的存在,但沒有测得精氨酸合成酶的活力。在鏈霉菌的細胞丙酮干粉中測得轉脒酶的活力,但不能以鏈霉胍或鏈霉胺作为酶的底物。作者們认为鏈霉菌細胞有鳥氨酸代謝循环系統的存在。鳥氨酸,CO_2和NH_3合成瓜氨酸,再由瓜氨酸轉变为精氨酸,后者經轉脒酶的作用,复轉变为鳥氨酸,这个循环的作用不断地供給了链霉素鏈霉胍部分的胍基的来源。     

木瓜蛋白酶的研究——Ⅲ.组氨酸及色氨酸残基为木瓜蛋白酶表现催化活性的必需基团

(一)木瓜蛋白酶在甲烯蓝存在时照光数分钟活力即显著下降,光氧化过程中組氨酸及色氨酸的破坏和活力的下降均按一級反应进行。組氨酸和色氨酸破坏的一級反应常数之和恰等于活力下降的一級反应常数。过程中酪氨酸及二硫鍵含量无显著变化。(二)NBS作用于木瓜蛋白酶引起的色氨酸殘基的破坏与活力的下降完全一致。(三)根据光氧化及NBS的作用过程中木瓜蛋白酶活力下降与組氨酸及色氨酸破坏的定量关系,可以认为木瓜蛋白酶的必需基团中包含一个組氨酸及一个色氨酸殘基。     

胎羊3β,20α-羟类甾醇氧化还原酶活性位点的组氨酸残基的鉴定

为进一步研究胎羊3β,20α-羟类甾醇氧化还原酶活性中心的特性,我们合成了放射性的16α-溴乙酸基孕酮和5α-二氢睾酮-17-溴乙酸酯作为亲和标记试剂。二者都是以不可逆的方式,活性位点定向地竞争性抑制酶的活性。当酶的浓度为1μmol/L,抑制剂的浓度为100μmol/L时,使酶失去一半活性所需时间(t_0.5)分别为75 min(16α-BAP)和480 min(5α-DTB)。当在反应混合液中有底物孕酮或5α-二氮睾酮存在时,可降低抑制剂对酶活性的抑制速度。把标记的酶用盐酸水解,用氨基酸分析仪进行分析,最后确定,位于酶的活性中心的被标记氨基酸为组氨酸,它可能在氧化还原反应过程中发挥着重要作用。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅲ.对硝基苯酰甲基溴对某些蛋白质活力的影响

对-硝基苯酰甲基溴(NPAB)在不太高的浓度之下对木瓜蛋白酶,核糖核酸酶,胰凝乳蛋白酶和胰島素等的生物活力有明显的抑制作用。当NPAB与胰島素或胰疑乳蛋白酶共同保温时,随着生物活力的下降也同时发生吸收光譜的变化。对于胰凝乳蛋白酶而言,355mμ光密度的增加与其活力的下降完全平行說明NPAB仅作用于一个必需基团,再从二氫肉桂酸对这一抑制作用的?た蠢?这一基团可能是酶活性中心的一部分。NPAB对胰島素及核糖核酸酶的作用受pH影响,說明这一反应受蛋白分手中解离基团的控制,并且从它的pK值看来,这一解离基团很可能是组氨酸的咪唑基。pH影响木瓜蛋白酶和胰疑乳蛋白酶与NPAB的作用較为复杂,可能有不只一种解离基团参与控制它們与NPAB的反应。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅰ.对不同底物水解作用的比较

(一)氢离子浓度对木瓜蛋白酶水解不同合成底物的影响均属于非竞争性类型,即对不同底物的米氏常数皆与pH无关,pH仅影响最大反应速度。因此很可能木瓜蛋白酶的米氏常数即等于其与底物结合的解离常数。(二)甲醇对木瓜蛋白酶水解Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2有抑制作用,但对Cbz-白-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解却有显著的促进作用。(三)甘氨酸乙酯对Bz-精-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解亦有促进作用,但活力提高的程度各不相同。(四)根据以上结果对木瓜蛋白酶的作用机制作了简短的讨论。     

柴油食烷菌B-5及其卤代烷烃脱卤酶DadA对卤代化合物的降解

【目的】柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)B-5是重要的石油降解菌。为研究其对卤代化合物的降解范围和降解机制,【方法】以不同的卤代化合物作为唯一碳源,观察菌株B-5在其中的生长情况;通过多重序列比对、系统发育分析和三维结构同源建模,分析该菌株基因组内一个假定的卤代烷烃脱卤酶(Haloalkane dehalogenase,HLD)DadA;利用大肠杆菌异源表达、纯化DadA,并测定了其对46个卤代底物的酶活。【结果】菌株B-5能够利用C3-C18链长范围的多种卤代化合物为唯一碳源生长;在系统进化树中,DadA相对独立于其他HLD-II亚家族成员,但具有典型的HLD-II亚家族的催化五联体残基;DadA确实具有脱卤活性,但该酶特异性高,底物范围明显小于其他已鉴定的HLDs,仅对1,2,3-三溴丙烷、1,2-二溴-3-氯丙烷和2,3-二氯-1-丙烯有脱卤酶活。【结论】因为DadA对很多B-5菌株可以利用做碳源的卤代底物没有脱卤酶活,所以推测B-5菌中可能还有其他脱卤酶参与了卤代烷烃的降解。菌株B-5及其卤代烷烃脱卤酶DadA在卤代烷烃污染物的生物降解方面具有应用潜力。