基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法

快速、高效删除大肠杆菌染色体DNA的目的基因是大肠杆菌代谢工程研究的前提和基础。利用Red重组系统结合Xer重组系统删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的ackA-pta基因和pps基因。实验证明了可重复应用dif位点实现大肠杆菌染色体上多基因突变的叠加,同时,在染色体上并未留下抗生素标记,借此能够高效地实现多基因缺失突变株的构建。此外,本方法重组效率高,实验步骤较简便。     

地衣芽胞杆菌活菌制剂的临床应用进展

整肠生是应用二十多年的地衣芽胞杆菌活菌制剂,已有大量的研究报道其临床有效性和安全性。地衣芽胞杆菌大量分泌种类丰富的消化酶,通过抑制肠道有害菌生长和促进有益菌增殖调节肠道菌群,并产生杆菌肽、地衣素和乙酸等生物活性物质发挥益生作用。本文总结了益生菌的益生特点,并重点分析了芽胞杆菌的益生特点,归纳了整肠生的作用机制与临床研究现状,揭示了其在肝脏疾病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、幽门螺旋杆菌感染以及病毒感染等疾病中的治疗作用,并对整肠生未来的临床应用方向进行了展望。     

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性

目的建立高产量和高活力的地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因表达体系。方法采用PCR技术克隆获得目的基因,将其连入表达质粒pET-32 a构建原核表达重组质粒,经测序鉴定后,转化BL21大肠埃希菌,不同温度下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活;进一步对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果碱性蛋白酶基因序列全长1 149 bp,编码382个氨基酸,同源性为99%,融合蛋白分子质量为62 kD,蛋白酶酶活为29 000 U/mL,并且在25℃时是以可溶蛋白形式表达,37℃时部分蛋白以包涵体形式存在。结论此种表达体系可以成功表达具有生物活性的碱性蛋白酶,诱导温度对蛋白酶存在形式具有较大影响。     

地衣芽胞杆菌培养条件的研究

应用单因素和正交试验设计试验法对地衣芽胞杆菌在摇瓶水平上进行了培养基配方和培养条件的研究。结果表明：最适培养基配方为山芋淀粉1．0％,豆粕0．6％,玉米芯粉0．8％,K2HPO4 0．1％,MgSO40．1％。最适培养条件为37℃,摇床转速150r／min,250mL三角瓶装液50mL,接种量5．0％,振荡培养48h,pH7．0。在20L自动发酵罐中进行了扩大培养试验,考察溶氧对菌体生长的影响,并根据试验结果进一步扩大至1m^3发酵罐,通过控制搅拌速度和通气量,1m^3发酵罐中地衣芽胞杆菌培养液菌浓为7．2×10^9efu／mL,芽胞率达到90％。     

枯草芽孢杆菌胞外氨肽酶对菌体生长的作用研究

【目的】利用基因敲除技术构建突变菌株BS-AP-K来研究枯草芽孢杆菌的分泌型氨肽酶对菌体生长的作用。【方法】基于Xer/dif重组系统敲除Bacillus subtilis 168基因组中ywaD基因,研究比较野生型与BS-AP-K菌株在不同培养基中的生长情况。【结果】通过比较两菌株的生长情况,发现敲除分泌型氨肽酶会对菌体生长带来不利影响,而这种影响可以通过在培养基中添加多种游离氨基酸来弥补。【结论】研究结果表明胞外氨肽酶通过酶切外源蛋白质以及多肽来为细胞生长提供营养所需。     

能量代谢工程促地衣芽胞杆菌DW2高效合成杆菌肽

杆菌肽是一种主要由芽胞杆菌产生的广谱性环肽类抗生素,目前广泛应用于兽药领域。能量代谢在微生物高效合成目的代谢产物中具有重要作用。文中以杆菌肽工业生产菌株地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis DW2为出发菌株,首先构建了呼吸链分支途径细胞色素bd泛醇氧化酶基因cydB缺失菌株,发现cydB缺失后杆菌肽效价和胞内ATP浓度相比于对照菌株分别提高了10.97%和22.96%。接着,证实了强化表达另外一条呼吸链分支途径——细胞色素aa3氧化酶基因qoxA能够提高杆菌肽合成水平,其杆菌肽效价和胞内ATP浓度相比于对照菌株分别提高了18.27%和34.00%。强化ADP合成供给也是促进胞内ATP积累的有效策略,结果表明强化表达腺苷激酶DcK和腺苷酸激酶AdK均可以提高杆菌肽效价和胞内ATP浓度,其中强化表达DcK效果较好,其杆菌肽效价相比对照提高16.78%。最后,通过组合代谢工程育种,在基因cydB缺失菌DW2ΔcydB基础上整合表达了qoxA和dck,得到工程菌株DW2-CQD(DW2ΔcydB::qoxA::dck),发酵结果表明,DW2-CQD杆菌肽效价达到954.25 U/mL,相比于对照菌株提高了21.66%,单位菌体杆菌肽效价为2.11 U/CFU,相比对照提高了11.05%。此外,DW2-CQD胞内ATP浓度为39.54 nmol/L,相比于对照提高了49.32%。结果证实能量代谢工程是提高杆菌肽发酵水平的有效策略,提供了一株具有工业化应用前景的杆菌肽生产菌株。     

地衣芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用

随着对地衣芽胞杆菌研究的不断深入和其杀虫、抗菌、生物降解等多种生物学活性的发现,地衣芽胞杆菌被认为是芽胞杆菌属中最具有生物防治应用价值的菌种之一。本文论述了地衣芽胞杆菌的生物学特性及其防治植物病害的四种主要作用机制,包括竞争、分泌抗菌物质、诱导植物系统抗性和促进植物生长;介绍了地衣芽胞杆菌在水稻、棉花、番茄、芒果、辣椒等多种大田作物和经济果蔬上的应用现状和生物防治效果;并讨论了其在生防应用过程中存在的主要问题,为今后地衣芽胞杆菌在生物防治方面的研究提供理论依据和应用参考。     

地衣芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用

随着对地衣芽胞杆菌研究的不断深入和其杀虫、抗菌、生物降解等多种生物学活性的发现,地衣芽胞杆菌被认为是芽胞杆菌属中最具有生物防治应用价值的菌种之一。本文论述了地衣芽胞杆菌的生物学特性及其防治植物病害的四种主要作用机制,包括竞争、分泌抗菌物质、诱导植物系统抗性和促进植物生长;介绍了地衣芽胞杆菌在水稻、棉花、番茄、芒果、辣椒等多种大田作物和经济果蔬上的应用现状和生物防治效果;并讨论了其在生防应用过程中存在的主要问题,为今后地衣芽胞杆菌在生物防治方面的研究提供理论依据和应用参考。     

地衣芽胞杆菌（CMCC63519）及代谢产物对部分细菌的抑菌作用

本文通过两个试验,证实了地衣芽杆菌的代谢产物对某些细菌有类似抗生素样作用。抑菌作用与代谢产物有关。     

地衣芽胞杆菌FLP/FRT基因编辑系统的构建及验证

地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。     

XerCD/dif位点特异性重组

大约10%~15%的大肠杆菌在染色体复制过程中会形成染色体二聚体。大肠杆菌染色体编码的重组酶XerC和XerD作用于染色体复制终点区的dif序列,以同源重组的方式将染色体二聚体解离为单体,使细菌得以正常复制分裂。编码霍乱毒素的噬菌体CTXΦ以位点特异的方式整合入霍乱弧菌染色体,但其基因组中不含有任何重组酶基因,其整合过程需要细菌染色体编码的XerC和XerD重组酶,且整合位点与大肠杆菌dif序列相似。XerCD重组酶基因和dif位点在细菌染色体广泛存在,表明其可能是染色体二聚体解离,噬菌体及其他外源基因成分整合入染色体过程中一种广泛存在的途径。文章对XerCD/dif位点特异性重组在细菌染色体二聚体解离、外源基因整合的研究进展进行综述。     

Nucleotide Sequence and Features of the Bacillus licheniformis gnt Operon

Bacillus licheniformis was able to utilize gluconate as thesole carbon source as efficiently as Bacillus subtilis did.Southern analysis indicated that B. licheniformis likely possessesonly one gnt determinant. The nucleotide sequence (6278 bp)of the B. licheniformis DNA containing the gnt operon was determined,revealing the five complete open reading frames (ORF; genes).The putative product of the first gene, oug, did not show anysignificant homology to known proteins, but those of the secondto fifth genes exhibited striking homology to the gntRKPZ genesof B. subtilis, respectively, indicating that they are the correspondinggnt genes of B. licheniformis. Not only is the organizationof the gnt genes of these two Bacilli highly conserved, butso are the cis regulatory elements of their gnt operon. Sequenceanalysis of the upstream regions of these two gnt operons impliedthat a chromosome rearrangement in B. subtilis might have occurredimmediately upstream of the gnt operon during evolution, causingit to diverge from a common ancestor into B. licheniformis andB. subtilis.     

Tangle analysis of Xer recombination reveals only three solutions, all consistent with a single three-dimensional topological pathway

The product of Xer recombination at directly repeated psi sites on a circular unknotted DNA molecule is a right-hand four-noded catenane. Here, we use tangle equations to analyze the topological changes associated with Xer recombination at psi. This mathematical method allows computation of all possible topological pathways consistent with the experimental data. We give a rigorous mathematical proof that, under reasonable biological assumptions, there are only three solutions to the tangle equations. One of the solutions corresponds to a synaptic complex with antiparallel alignment of recombination core sites, the other two correspond to parallel alignment of cores. We show that all three solutions can be unified into a single three-dimensional model for Xer recombination. Thus the three distinct mathematical solutions do not necessarily represent distinct three-dimensional pathways, and in this case the three distinct tangle solutions are different planar projections of the same three-dimensional configuration.     

Cloning and characterization of the glutamate dehydrogenase gene in Bacillus licheniformis

The gdhA genes of IRC-3 GDH-strain and IRC-8 GDH+ strain were cloned,and they both successfully complemented the nutritional lesion of an E.coli glutamate auxotroph,Q100 GDH-.However,the gdhA gene from the mutant IRC-8 GDH+ strain failed to complement the glutamate deficiency of the wild type strain IRC-3.The gdhA genes of the wild type and mutant origin were sequenced separately.No nucleotide difference was detected between them.Further investigations indicated that the gdhA genes were actively expressed in both the wild type and the mutant.Additionally,no GDH inhibitor was found in the wild type strain IRC-3.It is thus proposed that the inactivity of GDH in wild type is the result of the deficiency at the post-translational level of the gdhA expression.Examination of the deduced amino acid sequence of Bacillus licheniformis GDH revealed the presence of the motifs characteristic of the familyⅠ-type hexameric protein,while the GDH of Bacillus subtilis belongs to family II.     

Co-linear scaffold of the Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis genomes and its use to compare their competence genes

We have established the co-linear regions of Bacillus licheniformis, an industrially important bacterium, and Bacillus subtilis, a model bacterium. In the co-linear regions, revealed by PCR, gene content and order are presumed to be conserved. These regions constitute approximately 60% of the compared chromosomes. Sequencing of the competence genes of B. licheniformis allowed us to validate the approach, and to demonstrate how it can be used for the comparative analysis of complex genetic systems. A new insertion sequence, designated IS3Bli1, was discovered in the competence region of the analyzed B. licheniformis strain.     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

Cre/lox位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

来自于P1噬菌体的Cre/lox系统通过位点特异性重组可以迅速而有效地实现各种生理环境下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操作。Cre/lox系统作为目前基因打靶技术的核心工具,已被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、斑马鱼等高等真核模式生物。文章较为全面地介绍了Cre/lox系统的基本概况及其在高等真核生物中的应用,讨论了Cre/lox系统在研究中存在的主要问题和今后的发展方向,为利用该系统在不同高等生物中进行基因操作提供有用的参考。