中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及免疫效果评价

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S1蛋白,并对其免疫效果进行评价。方法:构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染Sf9细胞包装杆状病毒;重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白;用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;采用假病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中表达并纯化了S1重组蛋白;利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠3次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1∶102 400,免疫小鼠血清稀释至1/5120后中和百分比仍达50%以上。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能有效诱导产生高滴度中和抗体,为发展MERS-Co V重组蛋白疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性。正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性;表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100%。本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础。     

昆虫细胞表达的网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白及其免疫性

利用Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystems构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验(IFA)和免疫转印试验,均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REVenv。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后,可以诱发维持45d以上的特异性抗REV抗体,并可抵抗REV病毒感染。     

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

将近期引起传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×103;用Western blotting分析,在53kDa处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA检测抗体效价为8×102,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14d后,ELISA抗体效价为3.2×103,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(P0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。     

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

GP64表面展示元件与组Ⅱ HaSNPV出芽病毒的融合

利用杆状病毒组ⅠAcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)GP64信号肽(GP64SP),C-末端跨膜区(GP64CTD)及报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)构成的表面展示系统(gp64sp-egfp-gp64ctd),同源重组到组ⅡHaSNPV的多角体基因位置,筛选重组病毒。通过激光共聚焦观察,HaSNPV重组病毒感染Hz-AM1细胞后绿色荧光分布在质膜,表明GP64SP可以引导表达产物趋向于细胞膜。病毒感染后,收集并纯化重组的出芽病毒(BV),经Western blot检测,eGFP存在于重组病毒BV中。结果表明,组ⅠGP64表面展示系统中的重要元件GP64SP和GP64CTD能够装配到组ⅡHaSNPV BV上,可以用于组ⅡNPV表面展示目的蛋白。     

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白, 组 I类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64, 而组 II类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F。本文以组II类型的HaSNPV为研究对象, 研究组I类病毒的GP64能否在组 II类病毒中正确表达和包装。利用 Bac to Bac系统, 构建了带有 AcMNPV膜融合蛋白 GP64 和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64 egfp , 同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒 HaSNPVegfp , 通过对HaSNPVgp64 egfp 感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测, 证明GP64可在HzAM1中表达, 并被包装入子代BV。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

禽白血病病毒J亚群囊膜蛋白env基因的克隆和表达

禽白血病病毒J亚群（ALV－J）是90年代鉴定出的ALV的新亚群,其囊膜蛋白env基因序列别与ALV A－E亚群的有相当大的差别。为ALV－J env基因及春表达产物的特点,用PCR方法扩增出ADOL－4817毒株的env基因,并克隆进TA载体,经电泳鉴定大小为1.7kb。将克隆出的env基因与杆状病毒pBlue-Bac4表达质粒DNA连接,构建成转移性载体pBac4817env,通过与Bac-N-Blue杆状病毒DNA共转染,区得了重组病毒rBac4817env-2。该重组杆状病毒感染Sf9细胞,能高效表达env基因产物,免疫荧光分析结果证明,单克隆抗体G2或多价兔抗env gp37血清能识别Sf9细胞,能高效表达env基因表达的特异性抗原;Western blotting分析结果表明,表达的重组基因产物的分子量大小约为90kD-94kD。用这些重组基因产物免疫鸡可以诱导鸡导鸡产生出高滴度的抗ALV－J特异性抗体。这一结果提示,这种杆状病毒表达的重组基因产物有助于ALV－J env基因生物学特性的深入研究。     

在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC 4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60.在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60 与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4-VP60.以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Western blot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性.血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213.同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制.经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs).在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似.     

重组杆状病毒表达尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白的研究

构建了表达尼帕病毒(Nipah virus,NiV)囊膜功能糖蛋白F和G的重组杆状病毒rBac-NF、rBac-NG。Western-blot证实大小分别为61kD和66kD的重组融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)分别在rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞中获得表达,并且rNF前体F0可在昆虫细胞内进一步有效裂解为F1(~49kD)和F2;采用兔抗NiV病毒高免血清间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达F和G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。以rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞裂解液稀释后直接包被ELISA板,间接ELISA检测兔抗灭活NiV全病毒高免血清中的F和G蛋白特异性抗体,同样具有良好的敏感性和特异性;以rBac-NF和rBac-NG感染昆虫细胞培养物直接免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiVF和G蛋白特异体液免疫反应,产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,杆状病毒表达重组F和G蛋白抗原具有替代NiV全病毒,作为安全、经济、敏感和特异的诊断抗原的潜力,并为重组病毒亚单位疫苗防制尼帕病毒性脑炎的探索研究奠定了基础。     

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白,组Ⅰ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64,而组Ⅱ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F.本文以组Ⅱ类型的HaSNPV为研究对象,研究组Ⅰ类病毒的GP64能否在组Ⅱ类病毒中正确表达和包装.利用Bac-to-Bac系统,构建了带有AcMNPV膜融合蛋白GP64和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64+egfp+,同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒HaSNPVegfp+,通过对HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测,证明GP64可在HzAM1中表达,并被包装入子代BV.     

表达EB病毒主要膜蛋白的非复制型重组痘苗病毒毒力及体液免疫反应

利用表达EBV GP350/220的非复制型重组痘苗病毒VMA△CK及复制性重组痘苗病毒VMA,注射乳鼠脑内,观察毒力。同时,用VMA△CK及VMA免疫Bal/c小鼠,经ELISA测定其特异性抗体水平。免疫血清用抗体中和EBV感染Raji细胞抑制产生早期抗原（NEA）法测定其中和抗体滴度。将免疫血清与P3HR-1细胞共同孵育后,测上清中EBV滴度以观察抗体体制EBV从P3HR-1细胞中释放效应。结果发现,VMA△CK毒力明显低于VMA,其LD50为4.5PFU/0.02ml,而VMA△CK的LD50大于10^6PFU/0.02ml。VMA△CK与VAM免疫血清中抗GP350/220抗体水平无明显差异,而初兔后抗痘苗病毒抗体水平VMA免疫组较VMA△CK免疫组高5倍左右。VMA△CK免疫组血清中和抗体水平没有明显差异。VMA△CK免疫血清稀释度与P3HR-1细胞培养上清中EBV滴度有剂量依赖关系。     

N端融合外源蛋白的兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP6 0基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBACHIS2_B的 6 HIS表达标签下游 ,与线性化野生型杆状病毒基因组DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经蚀斑纯化后获克隆化重组杆状病毒pBLUEBACHIS2B_VP6 0。以重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,经SDS_PAGE和Westernblot检测显示高效表达一分子量为 6 9kD的重组蛋白 ,并且该蛋白可被兔抗RHDV高免血清识别。血凝试验表明 ,该重组蛋白可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2 1 6 ,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组病毒表达的融合有 6 HIS表达标签的衣壳蛋白仍可在昆虫细胞内自聚成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上相似的病毒样颗粒 (VLPs) ,并且该VLPs与兔抗RHDV高免血清作用后于电镜下可见凝集成团的现象 ,表明其与天然RHDV病毒粒子在抗原性上也极为相似     

用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病病毒pp38基因

鸡马立克病病毒(MDV)38kd磷蛋白(pp38)基因中包括起始密码子和终止密码子的完整编码序列被整合进杆状病毒AcNPV的转移载体质粒pVL1392,用所得的含pp38基因的重组转移载体质粒pVLpp38I与野生型杆状病毒AcNPV的DNA共转染昆虫传代细胞系Sf9细胞后,用荧光抗体法以抗MDV单克隆抗体H_(19)筛选到能表达MDVpp38的重组杆状病毒克隆BP38 I。免疫印迹试验表明,在重组病毒BP38 I感染的Sf9细胞溶解物中,可表现一条分子量约为35—36kd的为单克隆抗体H_(19)识别的MDV特异性蛋白带。     

BJ46a基因在昆虫细胞的转染、蛋白表达及超微结构观察

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a在杆状病毒表达系统的表达及宿主细胞Sf9超微结构的变化。方法将构建的杆状病毒重组穿梭载体Bacmid BJ46a,经Cellfectin脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,获重组杆状病毒颗粒;以高滴度病毒感染Sf9昆虫细胞,行Western blot观察BJ46a融合蛋白的表达。在病毒扩增、蛋白表达过程应用透射电镜和超薄切片技术观察Sf9细胞超微结构的变化。结果Western blot分析表明：在转染病毒的Sf9细胞出现BJ46a融合蛋白表达条带。电镜观察表明：Sf9细胞在病毒扩增过程,细胞核增大,病毒发生基质形成,杆状病毒在其周围装配。蛋白表达期间,杆状病毒量剧增,细胞核内外存在大量丝状纤维。结论BJ46a基因可在杆状病毒表达系统成功表达,并伴随着宿主细胞超微结构的显著变化,其结果为杆状病毒表达系统的研究奠定坚实的基础。     

尼帕病毒融合蛋白、受体结合蛋白的表达及特异性高免血清制备

尼帕病毒膜融合蛋白F和受体结合蛋白G在病毒感染和诱导机体产生保护性免疫中起重要的作用。通过PCR扩增获得尼帕病毒F1和G基因片段(均去掉信号肽和跨膜区),克隆至原核表达载体,IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白,Western blot表明重组F1、G蛋白与兔抗尼帕病毒血清具有良好的反应原性;同时将F1和G基因克隆至经改造过的杆状病毒表达载体,获得了含有目的基因的重组杆状病毒,接种sf9单层细胞,间接免疫荧光检测表明F1、G蛋白在杆状病毒中正确表达,并与抗尼帕病毒血清具有良好的反应原性。以纯化原核表达的F1、G蛋白免疫兔获得了抗F1和抗G重组蛋白的特异血清,Western blot和间接免疫荧光检测表明所制备的血清具有特异性。试验所表达的抗原和制备的特异血清可用于尼帕病的诊断。     

人类细小病毒B19壳蛋白VP2在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用BAC-TO-BAC系统获得了人类细小病毒B19壳蛋白VP2的重组昆虫杆状病毒,并在sf9细胞中表达出VP2。用蚀斑法纯化病毒,终末稀释法测定病毒滴度为3.6×108。Western印迹检测证实了表达蛋白的特异性,间接免疫荧光法可观察到细胞胞浆中的表达蛋白颗粒。