抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及特性

用杂交瘤技术制备了5株产生抗黄曲霉毒紊B₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中之一AFB1－2H8进行了较系统的研究。AFB1一2H8属IgC3。纯化腹水抗体效价约5×10⁶。ELISA检测标准毒素的线性范围为0．5～50ng／ml。最低检出量为0．01ng／ml。该单抗与参试的其它黄曲霉代谢物的交叉反应系数为0～0．21,该抗体有较大的应用价值。     

我国及部分国家B型肉毒毒素的中毒情况

肉毒毒素是自然界中已知毒性最强的毒素,通常被分为A～G共7个血清型,其中A、B、E型是最常见的人类中毒型别。肉毒中毒的流行特点与菌体的地域分布、各地居民的饮食习惯和社会活动都有一定关系。目前,除南极洲外的世界各大洲均有B型肉毒中毒的报道。我国、日本及欧洲B型肉毒中毒主要为家庭自制食物引发的食源性中毒,而美国则主要为婴儿肉毒中毒。近年来,创口型B型肉毒中毒与"注射型吸毒人员"的关联引起了研究者的注意。为了加深对B型肉毒中毒的了解,我们对我国及部分国家和地区的B型肉毒中毒情况做简要介绍。     

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

目的:预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性。方法:利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位。人工合成4条(P1,P2,P3,P4)表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素。结果:合成的多肽能与抗B型肉毒毒素的类毒素的马血清结合;多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体,其中P1、P3、P4产生的抗体对受毒素攻击的小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

A型肉毒毒素ELISA鉴别试验方法的建立

目的建立鉴定A型肉毒毒素的ELISA鉴别试验方法以替代传统的动物试验法。方法采用现代免疫学技术,制备马源性和兔源性抗A型肉毒毒素多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA,并就此初步进行方法学验证。结果所建立的ELISA具有良好的特异性、灵敏度、精密度和耐用性,具有替代动物试验方法的良好前景。结论在进一步验证和确认之后,该方法有望正式成为可用于鉴定A型肉毒毒素的试验方法以替代动物试验法。     

肉毒毒素及其检测方法研究进展

肉毒毒素是自然界中毒性极强的一类神经麻痹毒素,可引起人类和动物肉毒中毒。因其制备简单、毒性强,已被列为最具威胁的生物恐怖剂之一,同时也是重要的毒素战剂。其感染剂量极低,每个人都易感。肉毒中毒后,病情严重者一般2-3 d内即可能死亡。如采取正确及时的治疗,可使肉毒中毒死亡率降低,而快速检测方法的建立无疑是成功治疗的前提。本文就肉毒毒素及其检测方法做一综述。     

A型肉毒毒素在国内外的临床应用

在介绍Ａ型肉毒毒素结构、功能及性质的基础上,对其应用于临床治疗中的国内外情况进行了综述,旨在为此毒素的应用提供理论依据及实践经验,并指出以后应深入研究的重点,以使该毒素的临床应用更趋完美。     

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。     

外源性蛋白酶对肉毒毒素的作用初探

将B型肉毒毒素在毒素粗提阶段用胰蛋白酶处理,再经浓缩、柱层析和结晶得到纯化的B型肉毒毒素复合物。结果表明:B型肉毒神经毒素经胰蛋白酶处理后单链裂解为双链,在非还原条件下SDS-PAGE显示神经毒素条带,在还原条件下SDS-PAGE只显示轻(L)、重(H)二链条带,而不显示神经毒素条带;纯化后毒素复合物的比活性提高了5.9倍,达到1.60×108LD50/mgPr;HPLC显示活性成分峰面积所占比例增加了9.83%。     

治疗用A型肉毒毒素的制备及其质量控制

我国治疗用Ａ型肉毒毒素采用酸等电点沉淀,磷酸盐提取,核糖核酸酶处理,ＤＥＡＥ Ａ５０离子交换层析,硫酸铵浓缩及自然结晶等程序从Ａ型肉毒梭菌培养物中提取,并经稀释、冻干而成。它毒力强、纯度高、性能稳定,宜于长期保存。经生化、免疫学测定,毒素系神经毒素和血凝素的复合体,纯度为２５～３．０×１０７ＬＤ５０（小鼠,下同）／ｍｇｐｒ,ＯＤ２６０／ＯＤ２８０≤０．５５不仅达到了美国ＦＤＡ对注射用Ａ型肉毒毒素的质量要求,而且在冻干损失,稳定性方面还优于美国制品。     

Beacon公司微囊藻毒素检测试剂盒的性能评价

对一种进口微囊藻毒素ELISA试剂盒进行应用性能评价。用该试剂盒进行精密度实验,标准品添加回收实验,交叉反应实验以及样品检测比较实验。试剂盒的分析内检测精密度较高,分析间检测精密度偏低,加标回收率在73.5-97.8%之间,试剂盒抗体与MC-LR的交叉反应率很高,但与MC-RR、MC-LW、MC-LF等微囊藻毒素异构体交叉反应率偏低,在水样的测定中,试剂盒检测结果与本实验室方法检测结果基本一致。该试剂盒基本能够满足对水体中MC-LR的定性和定量检测要求。     

A型肉毒毒素轻链基因的克隆及其结构分析

以献报道的A型肉毒毒素基因全序列为标准,设计并合成一对引物,自肉毒梭菌基因组中扩增出肉毒毒素轻链基因片段,并将扩增产物与pGEM—T载体在体外连接,构建测序重组质粒,进行测序和基因结构分析。PCR扩增获得了产物为1 364bp的DNA片段,测序结果与DNA数据库对照检索分析证明,此基因片段与GenBank中的A型肉毒毒素LC基因的一致性达99．9％以上,可以认为克隆的基因为A型肉毒毒素LC基因。     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

鼠源抗B型肉毒毒素单链抗体噬菌体文库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。     

F型肉毒毒素的制备及类毒素免疫原性初探

将F型肉毒梭菌经适宜条件产毒培养后,以硫酸铵盐析和酸沉两种不同工艺制备的F型肉毒毒素,用分段脱毒法脱毒制备类毒素,分别免疫豚鼠、马匹后测定免疫血清抗体效价。结果显示,两种工艺制备的毒素其类毒素都具有较好的免疫原性。     

B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G),是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质。人类肉毒中毒主要是由A、B和E型引起。本研究克隆了B型肉毒毒素重链C端片段(Hc),在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用Ni离子亲和柱进行了纯化。Hc蛋白免疫后的BALB/c小鼠可以抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击。     

C型肉毒毒素的制备及类毒素保护力初探

将C型肉毒梭菌经适宜条件的产毒培养后纯化,并进行相关鉴定。制备的C型肉毒毒素用分段脱毒法脱毒,并进行类毒素保护力的初步研究。以不同蛋白含量C型肉毒类毒素免疫小鼠后攻毒,结果显示,蛋白含量为0.625μg的类毒素免疫2针或蛋白含量为1.25μg的类毒素免疫1针均可保护50LD50的C型肉毒毒素攻击。蛋白含量为5μg的C型肉毒类毒素与福氏不完全佐剂配制的抗原免疫小鼠3次所得抗血清的保护力(Anti LD50/ml)为4.3×104。说明用该纯化工艺制备的C型肉毒类毒素具有很好的免疫原性,作为抗原成分用于C型肉毒疫苗和C型肉毒抗毒素的研究和生产具有较好的应用潜力。     

A型肉毒聚合类毒素的制备及免疫原性研究

通过制备A型肉毒聚合类毒素,研究获得较好的免疫原性和反应原性的方法.通过碳二亚胺法,聚合A型肉毒类毒素,免疫小鼠,用ELISA检测抗体,成功地制备了A型肉毒聚合类毒素,免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性,研究A型肉毒聚合类毒素抗原的作用机制,获得具有中和活性的保护性抗体,对肉毒毒素中毒的防治具有重要意...     

A型肉毒神经毒素(BoNT/A)基因序列分析及其B细胞表位预测

比较GenBank中4个不同毒株的A型肉毒神经毒素（BoNT／A）的基因组序列,发现其基因序列的一致性高迭92．2％-99．9％。基于保守性高的BoNT／A氨基酸序列,根据BioSun和LaserGene软件包中的表住分析相关参数,辅以对BoNT／A蛋白的二级结构的分析,综合预测BoNT／A的B细胞表位。结果表明,BoNT／A轻链的142-150、284-292区段,轻链的284-292,重链的440-450、465-480、538-549、699-710、751-760、1087-1095、1224-1231、1263-1270区段是B细胞表位优势区的可能性较大。多参数方案井结合不同软件综合预测BoNT／A蛋白的B细胞表位,为进一步实验鉴定BoNT／A的B细胞表位及其多表位疫苗设计和研究奠定了基础。     

苦味酸法测定A型肉毒毒素中的明胶含量

目的注射用A型肉毒毒素中加入明胶作为稳定剂,建立并验证定量检测注射用A型肉毒毒素中明胶含量的方法。方法通过苦味酸与明胶特异性作用,产生强的吸收,采用紫外-可见分光光度计用外标法来检测注射用A型肉毒毒素中的明胶含量。结果通过一定浓度苦味酸与明胶作用,用分光光度计在520 nm处测定吸光度,检测限可以达到2.5 mg/L,检测范围可以达到10~100 mg/L。结论该方法具有良好的特异性、准确度、精密度和灵敏度,对于测定注射用A型肉毒毒素中的明胶含量有较好的参考价值。     

首次自肉毒中毒食品中分离的一株产生E型肉毒毒素的酪酸梭菌

对某卫生防疫站委托本研究室分离病原菌的一份引起肉毒中毒的食品一＂黄豆冬瓜酱＂进行检测和病原菌的分离,从中再次检出了Ｅ型肉毒毒素并分离到一产毒菌种,对该菌种的生物学及生化学特性进行检查,并检测其毒素基因（ＰＣＲ试验）。结果：该分离菌能产生Ｅ型肉毒毒素,ＰＣＲ检测结果也证明其具有Ｅ型肉毒神经毒素基因,但其多项生化特性与Ｅ型肉毒梭菌有明显差异,而与酪酸梭菌完全一致。结果说明该分离菌系产生Ｅ型肉毒毒素的酪酸梭菌,而非Ｅ型肉毒梭菌。由酪酸梭菌引起的食物中毒型肉毒中毒并从中毒食品中分离到该病原菌,这在国际上尚属首次报告。