中华大蟾蜍和花背蟾蜍染色体同源性研究

本文以培养 扣华大蟾蜍、花背蟾蜍的外周血淋巴细胞为实验材料,采用ＢｒｄＵ南极洲民法和胸苷标记的方法,获得了中华大蟾蜍与花背蟾蜍析搞分辨晚复制带,确定了中华大蟾蜍每一染色体的特征性晚复制区,并就中华大蟾蜍与花背蟾蜍的晚复纹带进行了精确比较,发现中华大蟾蜍与花背蟾蜍的染色体之间具有极高同源性,该结果说明,在相同的培养条件下,只要ＢｒｄＵ掺入Ｓ期的时间较为统一,显示复制带的条件基本一致的情况下,利用复     

中华大蟾蜍某些生物学参数的测定

中华大蟾蜍某些生物学参数的测定艾晓杰,陈燕,范佳佑１．南京农业大学动物医学院南京２１００９５２．贵州农学院牧医系蟾蜍在医学和生物学的实验上应用较多,其耳后腺的分泌物－蟾酥为重要的动物药资源￣［１,２］．本文对中华大蟾蜍（Ｂｕｆｏｇａｒｇａｒｉｚａｎｓ...     

中华大蟾蜍胚胎孵化酶的分离和提纯

研究证明,海胆、鱼、两栖类胚胎孵化主要是由孵化腺细胞分泌的孵化酶(hatching enzyme, HE)作用的结果。研究HE的意义在于:1.研究孵化腺细胞的分化和溶解卵膜的机理。2.搞清HE的性质将有助于提高水生动物的孵化率。我们在研究中华大蟾蜍孵化腺细胞的形成、分化及结构的基础上进一步对孵化酶进行了分离和提纯。     

孔雀石绿对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性研究

孔雀石绿(ＭａｌａｃｈｉｔｅＧｒｅｅｎ)是一种三苯甲烷染料,由于它有很强的毒性,多年来在水产养殖的疾病防治中经常使用:在鱼类养殖中使用015～02ｐｐｍ的浓度全池遍洒或用10ｐｐｍ的浓度浸洗15～30分钟来防治鱼类的水霉病等(郑曙明,1997)。同时用0002～0005ｐｐｍ孔雀石绿全池泼洒,或用02～05ｐｐｍ药浴2小时,或6～7ｐｐｍ药浴5～10分钟,也常用于防治蛙类蝌蚪的水霉病等(吴高升,1997)。孔雀绿直接进入水环境作为一种杀菌剂在水产养殖中使用多年,但对两栖类蝌蚪的影响末见报道,本文采用生物学上常用的实验动物中华大蟾蜍(Ｂｕｆｏｇａｒｇ…     

激光照射对中华大蟾蜍早期胚胎染色体的影响

应用YAG倍频激光器对中华大蟾蜍四细胞期胚胎进行照射,观察胚胎的生长、发育,并对激光照射致畸的胚胎在尾芽期用压片法进行染色体分析。实验结果表明：激光照射后正常的胚胎其染色体无变化,激光照射致畸的胚胎其染色体有丢失和加倍等变化。     

中华大蟾蜍卵球受精过程中的细胞学研究

用蕃红、亮绿染色对中华大蟾蜍卵子受精过程的不同时期进行了观察。 材料均为受精前后(0—190分钟)的卵子。用Bataillon液固定,连续切片,蕃红和亮绿复染。光镜下观察。 结果 中华大蟾蜍成熟未受精的卵子处于第二次减数分裂中期。纺锤体位于动物极中央皮层,中期染色体只被蕃红着色。授精15—20分钟,精子入卵,仍为杆状,精虫星光已开始形成;授精40分钟,雌雄原核已具雏形,亮绿着色很淡;授精70分钟,两原核相联,亮绿着色加深,授精90分钟,两原核体积最大,亮绿着色最深;110分钟出现染色线,亮绿着色减弱,染色线被蕃红所染。授精120分钟进入第一次卵裂中期。细胞质亮绿染色加深。染色反应上的变化,表明了细胞周期中核质之间物质的转移,卵细胞质着色有明显的区域差别,表明受精前卵就已存在着“初级分化”(见图版)。     

中华大蟾蜍卵母细胞质膜的外向整流型钾离子通道

我们用电压箝方法研究了中华大蟾蜍卵母细胞的膜生理特性。发现卵母细胞膜去极化至-30mV及更偏正时,有一持续的外向电流出现,该电流与去极化程度约呈正比增加,当膜电位箝在20mV时其峰值达3.7±1.4μA。该电流被钾离子通道拮抗剂TEA和4-AP抑制,TEA半抑制浓度为2.6mmol/L。氯通道拮抗剂9-AC(2.5mmol/L)无抑制作用。无钙的或钙离子浓度增加三倍的胞外灌流液均对该电流无影响、该外向电流的逆转电位随胞外钾离子浓度的改变而变化。胞外钾离子浓度增加十倍,逆转电位约增加47.3mV,而胞外钠、钙或氯离子浓度的改变对逆转电位基本上无影响,因此该电流可被认为主要是电压依赖性钾离子流。取自冬眠蟾蜍的卵母细胞经孕酮诱发成熟后,电压依赖性钾离子流减小,仅为原来的1/20-1/30,而取自全年在高温饲养的蟾蜍的卵母细胞经孕酮处理后未见成熟,其电压依赖性钾离子流仅减小至原来的三分之一。     

中华大蟾蜍多种组织内5—羟色胺免疫染色细胞的分布

The distribution of 5-hydroxytryptamine (5-HT) immunostaining cells in the digestive tracts (hibernation and nonhibernation), the brain and other various tissues of Bufo bufo gargarizans was studied by peroxidase anti-peroxidase immunocytochemical method. In the brain, 5-HT immunostaining cells were localized in the raphen nuclear area of brain stem and in the ependyma cell area of the ventriclus tertius of diencephalon. These immunostaining cells were round or oval. The cells usually possess processes which were filled with immunoreactive substance. Some of the processes were contact with the processes of other cells. A few 5-HT positive reactive nerve fibers were observed in the brain stem and the diencephalon. The density of 5-HT immunostaining cells in the digestive tubes were the highest in the pylorus, fundus, cardia of gaster, and moderate in the esophagus and duodenum and the lowest in the large intestine and the small intestine. The density of 5-HT immunostaining cells in the digestive tubes were higher in nonhibernant toads than in hibernant toads. By the statistical method, the difference of the density between the two sorts of toads were notable (P less than 0.05). The 5-HT immunostaining cells were visualized to distribute between the epithelium cells of the mucosa or the epithelium cells of gland. These positive cells usually had one or more processes which contained 5-HT immunoreactive substance. Some were reached into lumen surface of the gland or intestine. Some were extended into lamina propria through the basal membrane. These results indicate that the 5-HT immunostaining cells in digestive tubes could release 5-HT by both endocrine and exocrine ways.     

红藻氨酸和GABA受体在中华大蟾蜍卵母细胞的表达

本文报道了利用中华大蟾蜍卵母细胞作为外源性膜蛋白的表达及其功能特性研究的模式系统。将大鼠脑的mRNA微量注入蟾蜍卵母细胞(每个卵母细胞注射50ng),在19℃下经48h以上培养后,由外源mRNA表达的大鼠脑的红藻氨酸和γ-氨基丁酸受体被整合到了卵母细胞膜上。红藻氨酸(5×10~(-5)mol/L)和γ-氨基丁酸(10~(-4)mol/L)所诱导的膜电流分别达到294.0±6.4nA(n=5)和309.5±4.9nA(n=4)。红藻氨酸浓度在10~(-3)mol/L时,其诱导的膜电流达最大值。进而,注射mRNA的卵母细胞,~(36)Cl~-流入速度比对照组高一倍多。这些结果表明,中华大蟾蜍卵母细胞,如同爪蟾卵母细胞一样,能表达具有功能的外源膜蛋白(受体蛋白和离子运输蛋白)。     

浙江丽水中华大蟾蜍和黑眶蟾蜍蝌蚪对水位变化的表型响应

全球气候变暖引发栖息地干涸将对生活在水中的无尾类幼体提出了挑战。通过浙江丽水中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)和黑眶蟾蜍(Duttaphrynus melanosticus)蝌蚪在实验条件下对不同水位变化的表型响应,检测表型可塑性的遗传性和环境近因性影响。结果表明,水位变化对中华大蟾蜍蝌蚪早期发育历期、头宽和体重影响不显著,对体长影响显著,其中逐减水位最大、恒低水位最小,慢波、恒高与快波、逐增水位依次减少;水位变化对黑眶蟾蜍蝌蚪早期发育历期、体长、头宽和体重影响均显著;发育历期以恒高水位最大,恒低水位最小;体长以逐减水位最大,恒低、快波和慢波水位显著偏小,逐增和快波水位居中;头宽以恒低水位最小,逐增水位居中,其余较大;体重以恒低水位最小、恒高水位最大,其余居中。水位变化对中华大蟾蜍蝌蚪的变态时间、体长、头宽和体重影响均不显著;水位变化对黑眶蟾蜍蝌蚪的变态时间、体长和体重影响均显著,对头宽影响不显著;恒低水位的变态时间最长,恒高水位的变态时间最短,其他水位变化之间差异不显著;恒高水位的体长最大,恒低和快波水位最小,其他居中;逐增和快波水位的体重最大,恒低水位最小。研究结果表明,繁殖季节不同的中华大蟾蜍和黑眶蟾蜍蝌蚪响应水位变化的表型可塑性差异显著,长期在容易发生干旱和水位变化的冬季繁殖的中华大蟾蜍蝌蚪的表型可塑性低,在雨水充沛的春季繁殖的黑眶蟾蜍蝌蚪的表型可塑性高,表现出表型可塑性的种间差异和遗传性;在早期发育过程中,两种蝌蚪体长的共同的表型变异与缺乏遗传基础的环境近因性影响有关;黑眶蟾蜍蝌蚪对低水位或水位下降作出减速分化的消极响应,响应程度与环境信号的强弱直接相关。     

中华大蟾蜍蝌蚪变态过程中脊椎骨化次序

两栖动物在幼体变态即由水栖到陆栖的环境转变中,骨骼系统会发生重塑。本文采用茜素红和阿利新蓝的双染色技术对不同发育阶段中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪变态过程中(Gosner 38~46)脊椎骨的发育进程进行了形态学研究。结果显示,在中华大蟾蜍蝌蚪Gosner 39期,椎板中线处发生融合;荐前椎Ⅱ-Ⅷ和荐椎的椎体、椎弓起始骨化发生在Gosner 42期;其次荐前椎Ⅱ-Ⅷ和荐椎的横突、底索和荐后椎Ⅰ开始骨化;荐后椎Ⅱ骨化最晚;在Gosner 46期,尾杆骨最终形成。荐后椎愈合形成尾杆骨反映无尾类幼体由水栖环境转变为陆生环境中骨骼系统的机能适应。     

中华大蟾蜍输卵管促受精因子的实验分析

在孕酮作用厂,切除卵巢的中华大蟾蜍输卵管上皮细胞不仅能够使外源移植的卵母细胞在输卵管中正常运行,还保证卵母细胞正常受精。根据输卵管卷曲部分泌物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,存在依赖孕酮的３３ｋＤ蛋白质。经兔抗３３ｋＤ蛋白抗体处理具输卵管分泌物的卵母细胞,受精率受到显著抑制·提示该蛋白有促受精活性。输卵管分泌物介入受精涉及复杂的多种因子。     

除草剂草甘膦对中华大蟾蜍的慢性毒性

为揭示除草剂对农林生态系统中脊椎动物天敌潜在的、长期的慢性毒性,测定了草甘膦对中华大蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）蝌蚪生长发育和运动频率的影响以及对中华大蟾蜍成体空胃率的影响。结果表明,亚致死剂量的草甘膦溶液对中华大蟾蜍蝌蚪的生长发育和运动频率具有明显的抑制作用,蝌蚪体长、体宽、尾长、尾宽和体质量的增长率均与草甘膦浓度呈极显著负相关;蝌蚪的运动频率亦与草甘膦浓度显著负相关。同时,草甘膦的喷施对中华大蟾蜍成体的捕食造成负面影响,其空胃率与草甘膦浓度呈极显著正相关,即使在草甘膦的推荐使用浓度范围之内．中华大蟾蜍（成体）处理组亦出现30％～60％的空胃率。     

UVB影响中华大蟾蜍早期胚胎发育的初步研究

为了研究UVB对两栖类动物早期胚胎发育的影响,以中华大蟾蜍为研究对象,用UVB分别以不同强度和不同时间照射其二细胞期胚胎,观察记录胚胎的发育过程、统计死亡率并在形态学上对UVB照射诱导的畸胚进行分析。结果表明,30μW／cm^2强度的UVB分别照射二细胞期胚胎20s、60s和80μW／cm。强度分别照射20s、60s、120s后,对中华大蟾蜍早期胚胎发育有促进作用,使发育过程中的死亡率降低,畸胚出现的类型较少且畸变程度低;80μW／cm。强度的UVB照射二细胞期胚胎600s,100μW／cm^2强度的UVB照射20s、60s、600s,120μw／cm。强度的UVB照射20s,导致胚胎发育过程中死亡率明显升高,畸胚数量多且畸变程度高。结论：UVB照射剂量和时间不同,对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响有明显差异。     

中华大蟾蜍TAGLN2 cDNA的克隆与其组织分布

为研究蟾蜍(Bufo)基原的中药材中的多肽类有效成分,开展从日本蟾蜍(B.japonicus formosus)皮肤cDNA质粒文库中筛选蛋白编码基因的工作.由于后续拓展蟾蜍药用价值的研究中需要大量的实验材料,开始以中华大蟾蜍(B.gargarizans)皮肤第一链cDNA为模板,克隆其相关基因的工作.通过DNA聚合酶链式反应获得编码转胶蛋白-2(transgelin2,TAGLN2)的转录子(GenBank登录号为KF432856).该cDNA全长1 207 bp,其5′、3′端非翻译区域和开放阅读框分别为16 bp、597 bp和594 bp,编码由197个氨基酸残基组成的蛋白质,与日本蟾蜍的TAGLN2(GenBank登录号为AGQ03775.1)相比,仅一个氨基酸发生替换,与人的同源性为82%,与其他动物的同源性介于70%⁷5%.RT-PCR组织分布检测表明TAGLN2在所检测的中华大蟾蜍各器官中均有表达,在肺、肝和肾中表达量较多.这些研究结果为后续中华大蟾蜍TAGLN2的生物学功能研究以及相关药物研发提供基础数据.     

中华大蟾蜍卵母细胞质膜存在钙依赖性的氯离子通道

本文采用双微电极电压钳方法研究了中华大蟾蜍卵母细胞内源性电压门控型离子通道的成分及其生理特性。卵母细胞去极化至 -30 mV 及更正电压时,有一持续的电压依赖性外向电流出现。钾离子通道拮抗剂四乙基氯化氨(tetraethy-lammonium chloride, TEA, 10 mmol/L)和 4- 氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP, 10 mmol/L)协同作用时,该电流只能被抑制到最大电流幅度的(23.4±0.72)%。但是,上述浓度的TEA和4-AP 与氯离子通道拮抗剂5- 硝基-2, 3- 苯酚丙胺苯甲酸盐 (5-nitro-2,3-phenypropylamino benzoate, NPPB, 30 μmol/L)、无钙 Ringer 氏液或钙离子通道拮抗剂维拉帕米(40 μmol/L)协同作用时,可分别将此外向电流抑制到最大电流幅度的(2.1±0.08)%、(2.2±0.04)% 和(3.1±0.15)%。结果表明,中华大蟾蜍卵母细胞质膜上除有钾离子电流之外,还存在钙依赖性的氯离子电流。     

中华大蟾蜍蝌蚪变态过程中肩带与前肢的发育及骨化次序

本文采用骨骼双染色法,对中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)33~46期蝌蚪的肩带及前肢骨的发育和骨化次序进行了研究。结果显示,中华大蟾蜍蝌蚪的肩带从36期开始出现,39期通过肌肉与荐前椎Ⅱ、Ⅲ连接,在45期胸骨出现,肩带各结构的出现和骨化起始于肩臼窝邻近的范围;前肢骨出现及骨化的方向是从近端到远端、从轴后到轴前的。肩带和前肢骨的出现有助于缓冲无尾两栖类登陆后运动产生的振动,反映了无尾类蝌蚪在变态过程中由水栖生活到陆栖生活的适应。     

东方铃蟾与中华大蟾蜍肌组织钙激活ATP酶活性的比较研究

本文对东主铃蟾与中华大蟾蜍的心肌，腓肠肌和小肠平滑肌肌球蛋白钙激活ＡＴＰ酶活性进行了比较研究。实验结果表明东方铃蟾与中华大蟾无理蜍均显示出Ｃａ＋＋－ＡＴＰ酶活性的组织特异性。此外，东方铃蟾的心肌和腓肠肌中的Ｃａ＋＋ＡＴＰ酶活性低于中华大蟾蜍中相组织的酸活性；而东方铃蟾的小肠平滑肌中Ｃａ＋＋ＡＴＰ酶活性却高于中华大蟾蜍小肠平滑肌中酶活性。上术Ｃａ＋＋－ＡＴＰ酶活性的差异均具有一定的生理意义。     

中华大蟾蜍蝌蚪后肢骨的发育及骨化顺序研究

本研究对中华大蟾蜍Bufo gargarizans不同发育时期蝌蚪的腰带和后肢骨进行双染色。结果显示,在中华大蟾蜍蝌蚪中,后肢软骨化和骨化顺序都是由近端到远端,但在远端肢体的发育模式则呈轴后支配的特征。中华大蟾蜍蝌蚪Gosner 40期,两侧髂骨作合掌式对接融合,提示髂骨融合为无尾类由水生到陆生栖息环境的转换做准备。     

除草剂草甘膦异丙胺盐水剂对中华大蟾蜍心电活动的影响

采用生物信号采集处理系统对草甘膦异丙胺盐胁迫条件下中华大蟾蜍(BufogargarizansCantor)的心率和心电活动的相关指标进行了测定和分析。不同浓度的草甘膦异丙胺盐溶液被喷施到中华大蟾蜍的体表,由皮肤进入体内而作用于心脏。试验结果表明:随着草甘膦异丙胺盐处理浓度的增大,中华大蟾蜍的心率减慢,心电图中P波、R波和T波的电压峰值降低,而P-R间期、QRS期和Q-T间期的时值延长。草甘膦异丙胺盐胁迫条件下,蟾蜍心率与心电图的各项指标有显著相关性,可用多元线性回归模型分别对蟾蜍心率与心电图中P、R、T波和P-R、QRS、Q-T间期的相关关系进行拟合。多元回归分析结果表明,蟾蜍心电图中Q-T间期值对心率的影响最大,可以推断草甘膦异丙胺盐主要是通过延长蟾蜍心电活动周期中Q-T间期时值即心室收缩期而延长心动周期,导致蟾蜍心率减慢。由此可见草甘膦异丙胺盐水剂的喷施对中华大蟾蜍心脏的电活动周期和机械活动周期均造成了一定影响。