双报告基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶共同高效表达的双报告基因真核表达载体。方法:将增强型绿色荧光蛋白基因和海肾荧光素酶基因以昆虫病毒T2A序列相连接而后克隆进入pcDNA3.1(-)质粒,构建双报告基因真核表达载体。将该载体转染至COS-7细胞,通过荧光显微镜观察、照度计定量分析检测绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶生物活性,Western Bolt检测T2A序列自剪切效率。结果:双报告基因真核表达载体能够同时表达非融合的绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶,与单独表达载体产物具有相似的生物活性和表达效率。结论:双报告基因真核表达载体建立成功,为基因表达调控等相关领域研究提供辅助工具。     

甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中最适荧光蛋白报告基因的鉴定

近年来荧光蛋白成为基因工程中常用的遗传标记,详尽解读不同荧光蛋白基因在甲基营养菌中的表达可以鉴定最适的荧光报告基因。克隆了常用的绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP以及其他来源的绿色荧光蛋白wGFP和红色荧光蛋白RFP共5种荧光基因,构建相应的表达载体并在甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中进行表达。通过荧光成像观察和SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行荧光蛋白表达鉴定。通过细菌生长曲线、荧光总量和相对荧光强度的测定,进行荧光稳定性和表达强度的鉴定。结果在转化子中均检测到目的荧光蛋白条带,但RFP荧光表达量痕量且未检测到荧光成像;稳定性最强和相对荧光强度最高的是YFP,是常用eGFP的1.6倍,mCherry的3.4倍。在M. extorquens AM1中最适荧光蛋白为YFP。     

报告基因及其应用研究进展

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,在解析基因时空表达调控的内在规律中发挥着重要作用,它具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点.对目前已发展的多种报告基因(氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等)在动物、植物、微生物以及医学等领域的应用情况进行综述,为该技术的进一步拓展应用提供新线索和新思路.     

利用GFP表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程

绿色荧光蛋白(GFP)作为一种重要的报告基因,在病原菌和寄主之间的互作研究中具有良好的应用前景。利用草丁膦抗性基因bar为筛选标记,构建了组成性表达绿色荧光蛋白基因egfp的载体pBG,并转入球孢白僵菌获得成功表达。将转化子接种菜青虫进行生物测定表明,组成性表达egfp不影响球孢白僵菌的毒力。进一步利用冰冻切片和荧光显微观察技术监测球孢白僵菌侵染寄主行为,结果显示,通过荧光观察可清楚的检测到病原菌在昆虫体表的附着、菌丝穿透体壁以及菌丝从寄主体内长出等侵染过程。由此表明,GFP可有效用于球孢白僵菌的遗传标记,进行病原菌的鉴别、侵染致病机理及相关功能基因的表达模式研究。     

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架, 成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因, 潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG, 并利用根癌农杆菌介导转化系统, 成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框, 观察菌丝和分生孢子的荧光表型, 以及gfp基因的Southern杂交验证, 结果表明：被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5表达载体的构建

【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架,删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因,分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子P EF,构建表达载体pABN165P43和pABN165P EF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp,利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp.N16-5,通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp可以在Bacillus sp.N16-5中表达报告基因gfp,荧光定量数据显示,在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达,从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大,最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5表达载体,实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。     

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3’UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3’UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3’UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3’UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3’UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

EGFP-LacZ双报告基因真核表达载体的构建及体外表达

构建(β-半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达。采用PCR方法从质粒pLenti6/V5-GW/LacZ 中获取LacZ全基因,与pEGFP-C1重组后构建真核表达载体pEGFP-C1-LacZ。该重组质粒经PCR和酶切方法鉴定后,在脂质体介导下转染293FT细胞株及鸡胚成纤维细胞,通过荧光观察和组织化学方法检测Egfp和LacZ基因的表达。结果表明,LacZ基因被克隆到pEGFP-C1,成功构建了双报告基因真核表达载体。该重组质粒转染后的细胞呈现绿色荧光,组织化学方法检测到呈蓝色的细胞,表明两个报告基因均能在细胞内正确表达。     

利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平

目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后,结果检测不到报告基因的表达。为了提高报告基因的表达水平,将报告基因的读码框向后移动一个碱基,同时在其上游增加一个终止密码子,然后检测报告基因的表达水平。结果:通过移动报告基因的读码框同时在上游增加终止密码子,使报告基因的表达水平大大提高。结论:在构建基因表达载体时,通过改变目的基因与上游起始密码子ATG之间的相对位置以及增加终止密码子,可以大幅提高目的基因的表达水平。