2-萘酸细菌代谢途径的研究

采用质粒消除、转座子Tn10插入突变和回复突变等试验方法证实了2-萘酸细菌代谢途径中邻苯二酸环节的存在,探讨了2-萘酸代谢菌2-NAT菌株对2-萘酸代谢的调控机制。发现该菌至少带有一个质粒,该菌的2-萘酸代谢途径由质粒和染色体DNA共同编码控制。     

伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）2-萘酸单加氧酶基因（nmo）的克隆及表达

通过酶切连接将Burkholderia sp. JT1500的一段DNA片段(4.8kb)亚克隆到表达载体pUC18上,得到重组子pEK123。测序后的pEK123重组子48kb插入片段的序列已经登陆欧洲EMBL基因库,序列接受号为AJ566333。对这一DNA片段的序列分析显示,此DNA片段含有3个阅读框,且在这3个阅读框5′端发现一启动子特异序列。再用酶切连接方法得到仅含一个阅读框的重组子pXK3,其阅读框长度为1158bp,编码386个氨基酸,与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶（单加氧酶,bec）氨基酸序列有64%的同源性。pEK123对2萘酸代谢途径中4个关键底物的转化实验结果显示,其基因产物仅对2萘酸发生加氧转化反应,而且2萘酸浓度有明显的降低,证实此基因是2萘酸单加氧酶基因（nmo）。同时发现其基因产物也可以转化苯甲酸钠。该酶对苯甲酸的加氧转化途径正在研究中。 SDSPAGE结果表明,pXK3、pEK123两重组子中2萘酸单加氧酶表达量并没明显区别,但加氧酶酶活却存在显著的差别。推测在启动子后,单加氧酶阅读框前的两个阅读框的基因产物,对单加氧酶活有促进作用。     

2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)JT1500对2-萘酸(2-naphthoate)生物降解的关键步骤之一是通过2-萘酸加单氧酶羟化2-萘酸生成1-羟基-2-萘酸(1-hydroxy-2-naphthoate)。在已确定2-萘酸加单氧酶基因及其功能的基础上对含有该基因的一个4.8kb长度的基因簇进行了克隆测序。该序列上含有4个可能的阅读框orfB、orfC、orfD、orfA。序列比对发现,orfA序列与JaponicumUSDA110和RalstoniaeutrophaHF39中的加单氧酶基因同源性较高,orfB序列与BordetllapertussisTohamaI、RalstoniasolanacearumGMI1000和BordetellabronchisepticaRB50等菌中的黄素还原酶基因有一定的同源性。酶活分析发现只含基因orfA的重组大肠杆菌SA细胞提取液有很低的加氧活性,含基因orfB的重组子SB细胞提取液没有加氧活性,但在反应体系中同时加入SA和SB的细胞提取液后,其加氧活性显著增强,包含片段orfB orfA的重组子SB A在黄素(FMN、FAD)存在的情况下也表现出很强的加氧活性;在厌氧条件下,能检测出SB细胞提取液的黄素还原活性。基于以上信息,认为2-萘酸加单氧酶基因簇含有两个重要的组分黄素还原酶基因(nmoB)和加单氧酶基因(nmoA)。2-萘酸加单氧酶Nmo羟化2-萘酸的过程为先由黄素还原酶(NmoB)在NADH存在的条件下将黄素(FMN、FAD)还原为还原型黄素(FMNH2、FADH2),然后加单氧酶(NmoA)利用还原型黄素和O2羟化底物2-萘酸,生成1-羟基-2-萘酸。NmoB是NmoA的偶联蛋白。     

假单胞杆菌2-萘酸加氧酶基因的克隆与表达

采用Cosmid pLARF1构建了完整的2-萘酸代谢菌2-NAT菌株的基因文库.通过分析基因文库中产生蓝色色素的克隆验证了2-萘酸代谢基因在大肠杆菌体内得到表达,并导致重组细菌产生靛蓝.从产生靛蓝的克隆抽提重组的Cosmid DNA进行酶解分析,发现所有能产生靛蓝的克隆均含有一大小相同的DNA片段.用重组细菌进行靛蓝生物合成的试验展示了微生物法生产靛蓝的美好前景.     

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达

通过酶切连接将Burkholderia sp．JTl500的一段DNA片段(4．8kb)亚克隆到表达载体pUC18上,得到重组子pEKl23。测序后的pEKl23重组子4．8kb插入片段的序列已经登陆欧洲EMBL基因库,序列接受号为AJ566333。对这一DNA片段的序列分析显示,此DNA片段含有3个阅读框,且在这3个阅读框5’端发现一启动子特异序列。再用酶切连接方法得到仅含一个阅读框的重组子pXK3,其阅读框长度为1158bp,编码386个氨基酸,与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶(单加氧酶,bec)氨基酸序列有64％的同源性。pEKl23对2-萘酸代谢途径中4个关键底物的转化实验结果显示,其基因产物仅对2-萘酸发生加氧转化反应,而且2-萘酸浓度有明显的降低,证实此基因是2-萘酸单加氧酶基因(nmo)。同时发现其基因产物也可以转化苯甲酸钠。该酶对苯甲酸的加氧转化途径正在研究中。SDS-PAGE结果表明,pXK3、pEKl23两重组子中2-萘酸单加氧酶表达量并没明显区别,但加氧酶酶活却存在显著的差别。推测在启动子后,单加氧酶阅读框前的两个阅读框的基因产物,对单加氧酶活有促进作用。     

微波辐射法合成苄基-2-萘基醚的研究

在微波辐射条件下,以2-萘酚和氯化苄为原料,用氢氧化钠作碱剂,碘化钾作催化剂,以水和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂合成了苄基-2-萘基醚;采用单因素实验法,考察了反应物的摩尔比、催化剂用量、微波功率、辐射时间等因素对苄基-2-萘基醚产率的影响。实验结果表明:在n(2-萘酚):n(氢氧化钠):n(氯化苄):n(碘化钾)=1:1.1:1:0.018,水7 ml,DMF 25 ml,微波功率320 W和辐射时间75 s的优化条件下,苄基-2-萘基醚的产率可达88.03%。     

山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律

对山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律进行了初步研究。通过对这一混合发酵体系蛋白和尿素代谢的研究表明,氮源代谢与单一菌体发酵相比有其特殊性,主要表现在尿素的加入有两个作用,即作为生理碱性物质调节体系pH和为菌体代谢提供部分氮源,而体系的蛋白含量随发酵时间的延续不断增加,其增加的原因是巨大芽孢杆菌由营养体转变成芽孢所致,这是该发酵体系的特点。本文还对该发酵体系各种氨基酸变化规律进行了讨论,将一共17种氨基酸按其变化规律分成了三类,较好地解释了各种氨基酸的变化情况,为进一步深入研究该体系的动力学特性提供了数据基础。     

食酸丛毛单胞菌AN3菌株降解苯胺代谢途径的研究

食酸丛毛单胞菌(\%Comamonas acidovorans\%)AN3菌株中降解苯胺的酶类均为诱导酶,在以苯胺为唯一碳、氮源和能源生长的细胞中,含有苯胺双加氧酶、邻苯二酚2,3双加氧酶、2羟基己二烯半醛酸脱氢酶、4草酰巴豆酸脱羧酶和4羟基2酮戊酸醛缩酶等。苯胺双加氧酶作用于苯胺的\%K\%m值和\%V\%\-\{max\}分别为292μmol/L和3.57μmol\5mg\+\{-1\}·min-1;邻苯二酚2,3双加氧酶作用于邻苯二酚的\%K\%m和\%V\%\-\{max\}分别为16.4 mol/L和15.2μmol\5mg\+\{-1\}\5min\+\{-1\}。根据实验结果,推测了该菌株降解苯胺的代谢途径。     

mhbR和mhbT基因移码突变对3-羟基苯甲酸代谢的影响

Klebsiella pneumoniae M5a1菌株能以3-羟基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长,编码分解代谢3-羟基苯甲酸的基因被克隆至-8kb的DNA片段上(pBSI质粒),含有该质粒的大肠杆菌获得了以3-羟基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长的能力。经测序并与GenBank中的已知基因产物进行氨基酸同源性比较后,发现其中的mhbR与转录调节基因和mhbT与底物转运基因具有较高同源性,推断可能具有相应的功能。含有mhbR的移码突变子或mhbT的移码突变子的大肠杆菌在底物3-羟基苯甲酸中培养时,其生长速度和代谢速度都较野生型明显缓慢。     

共代谢条件下光合细菌对2-氯苯酚的生物降解

光合细菌PSB-1D不能利用2-氯苯酚(2-CP)作为唯一的碳源和能源.选用苹果酸、丙酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、苯酚、葡萄糖和可溶性淀粉等7种不同碳源作为光合细菌PSB-1D降解2-CP的共代谢基质,考察了在黑暗好氧培养条件下,不同共代谢基质对PSB-1D生长及降解2-CP效果的影响.结果表明:葡萄糖能够很好地促进PSB-1D的大量繁殖,提高降解效果,缩短降解周期,为最佳共代谢基质.对葡萄糖的投加浓度进行了优化,当葡萄糖的投加浓度为3 g·L-1时,菌株PSB-1D培养168 h后的菌体生长浓度△D560为1.749,2-CP的半衰期为3.9 d,降解速率常数为0.00864 h-1.采用SDS-PAGE对微生物全细胞蛋白质进行分析发现,在共代谢过程中当菌株PSB-1D利用葡萄糖作为底物提供能源和碳源时,可诱导产生2-CP特异性降解酶.     

代谢途径的进化

生物的新陈代谢是通过一系列的代谢途径来实现的.这些调节精妙、相瓦协作的代谢途径是如何进化形成的一直是一个引人入胜的重要问题.自1945年有关该问题的第一个假说--"逆向进化假说"提出以来,迄今已发展出七种假说,包括"逆向进化假说"、"半酶理论"、"向前发展模型"、"酶的招募假说"、"多功能酶特化假说"、"整个代谢途径的复制假说"和"从头创造假说".其中最受关注的是"逆向进化假说"和"酶的招募假说",而最近提出的"多功能酶特化假说"由于有较好的理论基础和实验证据支持,也逐渐引起人们的关注.本文对这些假说逐一作了概述,并结合作者的相关研究工作,对该领域的研究现状和发展趋势进行了分析讨论和展望.     

山梨糖发酵产生2—酮基—L—古龙酸氮源代谢规律

对山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律进行了初步研究。通过对这一混合发酵体系蛋白和尿素代谢的研究表明,氮源代谢与单一菌体发酵相比有其特殊性,主要表现在尿素的加入有两个作用,即作为生理碱性物质调节体系pH和为菌体代谢提供部分氮源,而体系的蛋白含量随发酵时间的延续不断增加,其增加的原因是巨大芽孢杆菌由营养体转变成芽孢所致,这是该发酵体系的特点。本文还对该发酵体系各种氨基酸变化规律进行了讨论,将一共17种氨基酸按其变化规律分成了三类,较好地解释了各种氨基酸的变化情况,为进一步深入研究该体系的动力学特性提供了数据基础。     

酵母菌合成2-苯乙醇的研究进展

2-苯乙醇是一种具有令人愉悦的玫瑰风味的芳香醇,在食品、化妆品和药品等领域具有广泛的应用。本文对酵母菌合成2-苯乙醇的代谢途径及其调控过程、以及提高2-苯乙醇产量的国内外研究进展进行了综述,并对通过微生物转化法合成2-苯乙醇目前存在的不足及进一步研究方向进行了讨论。     

细菌降解萘、菲的代谢途径及相关基因的研究进展

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类在环境中广泛存在的具有毒性的污染物,微生物降解是其在自然界中降解的主要途径,因而尤为重要。随着研究的深入,关于微生物降解PAHs的分子降解机制、途径等的认识逐渐积累。以下对细菌降解萘、菲的研究进展进行了概述,介绍了萘的水杨酸降解途径,菲的水杨酸、邻苯二甲酸及其他降解途径,同时也包括降解过程中涉及的降解基因簇,如nah-like、phn、phd、nid和nag等以及细菌在PAHs胁迫条件下其他相关基因的表达与调节等方面的最新进展。这些进展可为降解菌株的分子及遗传机制研究提供理论依据,将促进通过基因工程优化降解菌、更有效地检测PAHs环境污染及实现PAHs污染的生物修复。     

植物次生物的代谢途径

系统地介绍了关于植物次生物代谢途径方面的研究成果,归纳了植物次生物的3个主要代射途径:酚类代谢途径、萜类代谢途径、生物碱代谢途径,并对其代谢机理进行了探讨。     

代谢途径数据库简介

复杂的代谢途径分支比线性的基因、基因组和蛋白质序列更难以表示和搜索，介绍了INTERNET上常见的代谢途径数据库，并对其站点、内容和功能以及使用技巧作了简要的阐述。     

一张适用于总结物质代谢途径的代谢联络图

介绍了一张适用于总结物质代谢途径之间相互联系的代谢联络图。通过此图可让学生对营养物质代谢、能量代谢及其彼此之间的联系有一个整体的认识,还可显现出各条代谢途径间的枢纽性物质,以总结归纳这些物质的来源和去路,并在分子水平上阐明与代谢有关的某些疾病的原因。     

代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。