判断基因中点突变使用的寡聚核苷酸探针

本文简明扼要地介绍了人工合成寡聚核苷酸探针的设计原则,以及用 ³²P标记等方法。同时还从理论上阐述了19聚体探针在生物实验使用中的合理性,并强调在检测基因的点突变时,设计人工合成的寡聚核苷酸探针应将点突变位点置于探针序列的中间为宜。在选择序列时,要注意避免发生G-T错配,这样有利于鉴别基因的点突变。     

寡聚核苷酸探针在近交系小鼠遗传检测中的应用

用两个非放射性标记的寡聚核苷酸探针(GGAT)4和(GTG)5制作BALB/c、C57BL/6J、DBA/2、C3H等4种近交系小鼠的DNA指纹图,比较了两种探针在近交系小鼠遗传检测应用中的重复性和稳定性。结果表明,两种探针对上述4种近交系小鼠产生的DNA指纹图的图带数均为8～12条,具有良好的多态性。品系内的平均DNA指纹图相似系数(-x)在0·92～1·00的范围内,具有相同指纹图的概率(P)均在0·31以上,极显著地高于品系间的相似系数(0·22～0·39)和相同指纹图的概率(P<1·07×10-4)。说明(GGAT)4和(GTG)5两种寡聚核苷酸探针均可用于制作近交系小鼠的DNA指纹图,以对其进行遗传检测。用两种不同的探针进行DNA指纹分析,可以检出基因组中更多的个体特异性信息,结果更加可靠。     

多荧光标记引物增强甘蔗染色体寡聚核苷酸探针杂交信号

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）是植物分子细胞遗传学研究最为重要的手段之一。近些年,基于参考基因组设计的低拷贝寡聚核苷酸探针在FISH中应用得越来越广泛。然而,由于植物基因组中分布大量的重复序列,这使得oligo-FISH的分辨率存在一定局限性。利用包含多个荧光基团的荧光PCR引物,扩增出甘蔗染色体特异oligo探针,并进一步优化甘蔗的荧光原位杂交体系,提高了甘蔗oligo探针识别近缘物种染色体的效率。通过开发多荧光标记的甘蔗oligo探针以及甘蔗荧光杂交体系的优化,有效拓宽荧光信号的最小分辨率,提高信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）,并成功基于甘蔗oligo探针对高粱1-10号染色体分型。多荧光标记引物增强oligo探针信号的新方法及FISH体系的优化为今后在其他物种中提高oligo-FISH鉴定染色体及捕捉微弱的荧光信号提供了参考。     

反义寡聚核苷酸：生理学研究中的新工具

反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotide,AS-ON）通常是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的核酸片段。AS-ONs技术的近来应用为生理学研究开辟了一条新路,对将来了解基因的功能提供了一种新手段。本文综述了AS-ONs的设计策略、作用机理、修饰和导入方式等基本问题,旨在对AS-ONs的应用提供参考。     

TGFα反义寡聚核苷酸对膀胱癌BIU 87细胞株的作用

报道了23碱基组成的TGFα反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷酸对人膀胱移行细胞癌BIU87细胞增殖及其TGFα mRNA表达的作用,结果表明:TGFα反义寡聚核苷酸抑制体外培养的BIU87细胞的增殖、DNA合成和TGFα mRNA的表达,进一步证明了TGFα在BIU87细胞恶性增殖中的重要作用.     

特异寡聚核苷酸对猪瘟病毒在细胞中增殖抑制作用的研究

本实验探讨了寡聚核苷酸对CSFV复制的影响以及作为抗CSFV新型药物的可行性。实验结果表明针对CSFV5'um端非编码区NS3蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核酸对CSFV复制均有显著的抑制作用,而针对CSFV3' 端非编码区寡聚核苷酸仅有轻微抑制作用,5'端寡聚核苷酸具有最佳抑制作用,同时发现相应序列中正义聚核苷酸的作用要优于反义寡聚核苷酸;脂质体介导转染能显著提高寡聚核苷酸对CSF复制的抑制作用。这些初步结果也提示,CSFV5'端和3'端非编码区对CSFV复制的重要性和作用有所不同。     

5′-核苷酸的合成方法比较

5′-核苷酸在农业、食品和医药行业有着广泛的用途。比较了目前5′-核苷酸的工业和实验室合成方法,包括化学合成法,微生物发酵法,酶解法和酶催化法。     

寡聚脱氧核苷酸的结构与抗降解特性的研究

合成了４段具有不同高级结构或不同修饰的寡聚脱氧核苷酸,检查它们在２０％血清中的稳定性．发现：（１）寡核苷酸主要被血清中的３′外切核酸酶降解,未经修饰的线性寡核苷酸降解严重;（２）末端部分硫代修饰的寡核苷酸稳定性明显提高;（３）自身互补形成的配对结构可有效保护３′末端．具有４个以上（含４个）ＧＣ对的３′端发夹结构寡核苷酸,其抗核酸酶的能力几乎与硫代修饰的寡核苷酸相当．     

阳性脂质体介导反义寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果研究

采用FITC标记的未经修饰的和经过修饰的两种19-mer反义寡聚核苷酸序列(ODN19和S-ODN19)作为转染物质,用流式细胞技术(FCM)研究比较几种常用阳性脂质体介导的寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果及适宜的转染时间。未经化学修饰的ODN19转染结果显示,LipofectAmine和DM-RIE-C增强转染的作用相对较强,而其他两种脂质体的作用并不明显。对于经过修饰的S-ODN19转染而言,四种阳性脂质体均具有增强S-ODN19转染作用,但以LipofectAmine的效果最为明显,其转染效果(FITC均值为5203.11)为无脂质体介导对照的数十倍。四种阳性脂质体的增强转染作用排序为:LipofectAmine>FuGENE6>Lipofectin>DM-RIR-C。另外,在用FuGENE6介导寡聚核苷酸转染时,采用4小时转染时间可获较好转染效果。     

一种双脱氧核苷封闭的寡聚核苷酸制备方法北大核心

[目的]建立一种高效、简便制备双脱氧核苷(ddATP、ddTTP、ddGTP和ddCTP)封闭寡聚核苷酸的方法。[方法]选取乙醛脱氢酶(ALDH)基因,设计特异性上、下游引物。使用末端转移酶和碱性磷酸酶对引物进行双脱氧核苷修饰,利用荧光定量PCR对制备的封闭引物进行验证,并结合校读PCR对突变体进行检测。[结果]经过ddNTP封闭的引物,在普通荧光PCR体系中无法进行引物延伸;在校读PCR体系中则可以区分ALDH2的两种等位基因。[结论]该方法可以高效合成4种双脱氧核苷封闭的寡聚核苷酸,并且这种封闭的引物可以结合校读PCR对单核苷多态性进行检测。     

特异寡聚核苷酸对猪瘟病毒在细胞中增殖抑制作用的研究

本实验探讨了寡聚核苷酸对CSFV复制的影响以及作为抗CSFV新型药物的可行性.实验结果表明针对CSFV5'端非编码区NS3蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核苷酸对CSFV复制均有显著的抑制作用,而针对CSFV3'端非编码区寡聚核苷酸仅有轻微抑制作用,5′端寡聚核苷酸具有最佳抑制作用,同时发现相应序列中正义聚核苷酸的作用要优于反义寡聚核苷酸;脂质体介导转染能显著提高寡聚核苷酸对CSFV复制的抑制作用.这些初步结果也提示,CSFV5'端和3'端非编码区对CSFV复制的重要性和作用有所不同.     

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达,合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列,多聚酶蛋白编码基因起码上游及内部序列３．５ｋｂＲＮＡ３＇端起始负链ＤＮＡ合成序列互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物,分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现,当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／ＬＪＦ ,四种ＯＤＮ均能抑ＨｅｐＧ２．２．１５细胞     

寡聚核苷酸芯片表达谱系统偏移的校正算法

多芯片对比实验中,由于多方面的变异因素,使得芯片间存在明显的系统偏移.因此,芯片表达谱数据的校正处理是关键的数据预处理步骤.当前,已经提出了很多校正算法,比如:比例常数校正、非线性校正、分位数校正等.提出了一种新的校正算法.在选择的最小秩差异探针集上,进行非线性M-A校正.并采用迭代策略减弱基准芯片方法对基准芯片选择的敏感性.在标准测试集上,同几种已知的方法进行了对比分析.     

用甲基化的寡聚核苷酸作反义制剂

在含甲基磷酸根的寡核苷酸中,核苷酸之间含有非离子键,能抵抗细胞核酸酶的降解。一这种寡聚物能被培养的哺乳动物细胞完全吸收,它们能与细胞或病毒mRNA的启始密码或编码区或前体RNA的拼接位点有效的结合,特异性地抑制mRNA在细胞中表达。在甲基磷酸根寡核苷酸上衍生与靶mRNA共价交联的功能团,可以增强这种反义寡聚物的效率。这种寡聚核苷酸类似物是研究和控制基因表达的有用工具,并有希望开发成为治疗制剂。     

3′-末端标记法制备乙型肝炎病毒(HBV)直接重复序列(DR)的生物素化的寡核苷酸探针

本文首次报告用3’—末端核苷酸转移酶将生物素—11—dUTP标记到人工合成的21寡核苷酸上,该d(NMP)_(21)与HBV DNA长链缺口区附近的序列互补,并含HBV DNA的直接重复序列(Direct Repeat)。本文对其标记条件、检出方法进行观察比较,找出合适的条件,制成的生物素化d(NMP)_(21)探针可与标准的HBVDNA进行杂交,检测敏感度为25pg。用这种探针可以从乙型肝炎病人血清中检出HBV DNA。     

寡聚核苷酸用于治疗的前景探讨

寡聚核苷酸用于治疗的前景探讨陆长德（中国科学院上海生物化学研究所２０００３１）具有专一顺序的寡聚核苷酸可用于阻断有害基因的表达,是一种全新的治疗方法。由于它具有很高的特异性,它的降解产物对人体无毒,因此很有吸引力。近年来,寡聚核苷酸用于治疗的研究已进人动物和临床试验阶段,表现出很大的潜力。一、寡聚核苷酸阻断墓因表达的作用机制根据基因表达的中心法则,从贮存在ＤＮＡ中的信息产生有功能的蛋白质,其其中间体是信使RNA。     

内毒素耐受对核苷酸结合寡聚化结构域2信号通路的影响

为研究内毒素耐受对核苷酸结合寡聚化结构域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2,NOD2)信号通路的影响,将小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7分为两组,分别给予小剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(100ng/mL)或磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)预处理20h,建立内毒素耐受组和对照组。每组细胞分别给予大剂量LPS(1 000ng/mL)或热灭活烟曲霉孢子刺激,于刺激后0、2、6、12、24h采用定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细胞NOD2、受体相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2,RIP2)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)mRNA表达;采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)和TNF-α浓度。结果显示,内毒素耐受组无论是大剂量LPS还是热灭活烟曲霉孢子刺激均不能增加NOD2、RIP2和TNF-αmRNA表达及细胞上清液中IL-8、TNF-α浓度;而对照组大剂量LPS和热灭活烟曲霉孢子刺激均可提高NOD2、RIP2和TNF-αmRNA表达及细胞上清液中IL-8、TNF-α浓度,尤以刺激后12h增加显著,与刺激前(0h)比较,差异有统计学意义(P0.05)。结果提示,内毒素耐受可能对NOD2信号通路有抑制作用。     

5＇-核苷酸的合成方法比较

5’-核苷酸在农业、食品和医药行业有着广泛的用途。比较了目前5’-核苷酸的工业和实验室合成方法,包括化学合成法,微生物发酵法,酶解法和酶催化法。     

碱基上的氨臂对T4多核苷酸激酶催化的影响

寡聚核苷酸内部和5′末端含有的氨臂修饰胸苷酸,能够明显地影响T₄多核苷酸激酶催化的[γ- ³²P]ATP的转移反应.其转移效率为未修饰寡聚核苷酸的50%和2%.这种修饰的寡聚核苷酸对T₄ RNA连接酶催化的反应没有影响.