激素和活性多肽

本文论述了在一种宿主生物中生产外源蛋白的方法.产物通过宿主的分泌途径而得到加工.采用至少含有酿酒酵母基因信号肽编码区域与一种外源基因的融合物的载体对寄主进行转化,由此进行生产和加工.     

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性

利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物, PCR获得MMLV-rt基因片段; 再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变, 测序正确后, 插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt; 表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度, 再用RT-PCR 对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt 经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白, 通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白, SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%, RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品, 为大规模生产该酶提供了可靠的保证。     

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性

利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物, PCR获得MMLV-rt基因片段; 再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变, 测序正确后, 插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt; 表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度, 再用RT-PCR 对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt 经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白, 通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白, SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%, RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品, 为大规模生产该酶提供了可靠的保证。     

生物信息学预测与实验验证相结合策略筛选鉴定新的人分泌蛋白基因

使用生物信息学预测结合实验验证的策略筛选鉴定人新的分泌蛋白基因。用SignalP、SOSUI、PSORT和BLAST等程序对UniProt蛋白数据库进行生物信息学分析 ,筛选出用于实验验证的 1 4个功能未知基因。采用RT PCR方法 ,克隆得到 1 4个基因的全长编码序列 ,并构建到真核表达载体pcDNA3.1 ( - ) Myc His质粒。采用蛋白质印迹与免疫荧光分析 ,检测到其中 7个基因的表达。除其中一个在细胞核表达外 ,其余 6个只在细胞质中表达 ;其中的 4个基因的表达产物在细胞培养液中可被检测到 ,鉴定为 4个新的分泌蛋白基因。     

重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得特异性高的导向溶栓药物,应用PCR技术,得到抗人活化血小板单抗(SZ-51)的Fab′基因片段。再用酶切方法,将Fab′中CH1基因片段替换成合成的连接分子(linker)基因,构建成单链抗体基因,并插入到人尿激酶原分泌肽基因及低分子量单链尿激酶(scu-PA-32k)之间,最终构建成重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原融合蛋白基因。此融合蛋白基因在昆虫细胞中得到表达。纯化的表达产物SDS-PAGE鉴定,其分子量约为60kD,与预期值相符。其比活为9000IU/mg蛋白。ELISA法初步证明此重组的融合蛋白具有与活化血小板抗原结合特异性。     

纳豆激酶基因的表达及纯化

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到纳豆激酶基因(NK),利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体pETNK。在诱导下,实现了在大肠杆菌中高效表达,经SDS-PAGE电泳分析和薄层扫描结果显示,表达的目的蛋白占菌体蛋白的21．5％。将表达产物经过DEAE-Cellulos-DE52和Sephedax-G100两个柱分离纯化,得到纯的纳豆激酶蛋白干粉,经琼脂糖-纤维蛋白平板法测出纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于200u尿激酶。从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

青枯菌hrp基因的研究进展

青枯菌的hrp基因可诱发植物的超敏反应.对其基因组全序列测定表明:hrp基因簇位于基因组的大质粒上,共有20多个基因组成.从青枯菌中分离得到的可直接诱发植物超敏反应的效应蛋白主要为pop基因编码,它由hrp基因编码的类型Ⅲ蛋白分泌通道释放.目前的研究表明:(1)在hrp基因簇中,hrpY、hrpX及hrpV与分泌通道的一种纤毛的组装有关;(2)hrpB是整个类型Ⅲ蛋白分泌通道基因的转录激活子并作用于基因组中的其它效应基因;(3)hrpG是植物信号对hrp,基因的表达进行级联调控的组分之一.     

软腐欧氏杆菌的Ⅲ型分泌系统对harpin蛋白的识别与分泌

本文研究软腐欧氏杆菌分泌致病蛋白的Ⅲ型分泌系统的组分是否能识别梨火疫欧氏杆菌存在于mRNA上的分泌识别信号。用PCR的方法,将带有上游75bp可以在其mRNA的5′端形成一个典型的作为Ⅲ型分泌识别信号的茎环结构的梨火疫欧氏杆菌的诱导植物过敏反应的harpin的基因hrpN,从带有hrp基因簇的质粒pCPP430上克隆到pGEM\|T载体上,获得重组质粒pWGF1,经化学法转化到hrpN基因的转座突变体DH5α(pCPP430hrpN-)中,同时将pWGF1电击转化到胡萝卜软腐欧氏杆菌Se9R中,转化子的无细胞抽提物(CFEP)经Western\|blot检测到harpin蛋白已被表达;带有双重质粒的DH5α(pCPP430hrpN-/pWGF1)在番茄植物上可以引起过敏反应,Se9R(pWGF1)在大白菜上的致病力明显低于Se9R,初步表明一种植物病菌的harpin蛋白可被另外一种病菌的Ⅲ型分泌系统所识别、分泌并保持生物活性。     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ用pMAL-p2X载体的表达和纯化

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ基因通过PCR扩增 ,插入pMAL p2X载体 ,基因 5′端插入凝血酶切割位点 .在大肠杆菌中经IPTG诱导高效分泌表达 .表达产物N端含麦芽糖结合蛋白 ,融合蛋白被分泌到大肠杆菌的胞间质 .经冷渗透休克后 ,透析脱盐 ,用凝血酶切割融合蛋白 ,再经SuperdexTM75分子筛柱层析、高效液相色谱反相C18柱纯化 ,得到重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ .质谱分析表明 ,rHWTX Ⅺ系正确表达产物 ,重组HWTX Ⅺ表现出与天然HWTX Ⅺ一致的生物学活性 .     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体。它能高效表达且有效地分泌表达产物。利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白。融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体,它能高效表达且有效地分泌表达产物,利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白,融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

性别及日龄对转人神经生长因子基因小鼠唾液中蛋白分泌的影响

神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种能促进神经元发育、分化、再生的蛋白。为高效生产药效更佳的人源NGF (hNGF)药物,最近,笔者实验室构建出唾液腺特异表达hNGF的转基因小鼠,并从该转基因小鼠唾液中纯化获得具有高生物学活性的h NGF蛋白。为了选择性别和日龄最适宜的转hNGF基因小鼠用于收集纯化hNGF蛋白,文中比较了28日龄(性成熟前)雄性、雌性,63日龄(性成熟后)雄性、雌性转hNGF基因小鼠,共4组转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液鼠源NGF (mNGF)蛋白量和唾液h NGF蛋白量等指标。结果显示,63日龄的转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液mNGF蛋白量和唾液hNGF蛋白量显著高于28日龄同一性别的转hNGF基因小鼠,且63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白量显著高于同一日龄的雌性转hNGF基因小鼠;在4组小鼠中,63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF含量最高,比28日龄雌性转hNGF基因小鼠高出约46倍,最适宜用于收集唾液并从中纯化hNGF。     

两个人生长激素基因在SV40病毒重组体感染的猴细胞中的表达

我们已经建造了带有两个不同的人生长激素(hGH)基因的SV40重组体。用这些重组体感染的猴肾细胞能合成、加工并分泌人生长激素。有着与克隆的人生长激素互补DNA(eDNA)同样编码序列的基因1,共产物从几个标准来看,与垂体hGH没有什么区别。预定编码一个变异蛋白质的基因2,其产物比垂体hGH的免疫反应活性要小,但能有效地与hGH细胞表面受体结合。这些结果表明,基因2有可能表达而产生我们以前未辨别的hGH形式。这些结果显示了在真核细胞中,用基因转移的方法产生成熟的激素是可能的。这些结果也证明了SV40—猴细胞系统可以用于生产和鉴定动物细胞分泌的蛋白质。     

A组人轮状病毒VP6基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

轮状病毒(rotavirus RV) 结构蛋白VP6位于病毒三层衣壳结构的中间层,在病毒粒子的形成过程中起重要的作用。从临床样品中分离的人轮状病毒TB-Chen株VP6基因通过RT-PCR得到扩增产物。以pET作为表达载体,将VP6蛋白编码基因序列插入到质粒pET中成功构建原核表达质粒pET-VP6。实验表明,带有pET-VP6质粒的大肠杆菌BL21(DE3)可以高效表达目的蛋白VP6,重组表达产物VP6占菌体总蛋白的27.4%, 其分子量约为45 kDa,并且能被豚鼠抗SA11血清抗体识别（Western blot）。这一结果为进一步研究VP6的结构和功能奠定了重要的物质基础。     

油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建

根据已知序列设计引物,通过PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因序列。先将该酶4个亚基的基因进行拼接,然后将这4个拼接好的片段,克隆到pMD18-T载体上,得到质粒pH BM714。再以质粒pHBM714 DNA为模板,用分别带有CpoI和Asc I酶切位点的引物进行PCR扩增,PCR产物在dTTP的保护下经T4 DNA聚合酶处理,与将质粒pHBM720DNA纯化后经CpoI和AscI双酶切后得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌Xl_(10)-gold,得到正确的重组子命名为pHBM726。此质粒pH BM726,即为带有壮观霉素抗性基因(aadA)筛选标记的质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因油菜叶绿体单交换表达载体;在此载体中壮观霉素抗性基因(aadA)、乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因(ACC)和绿色荧光蛋白基因(gfp)共6个基因串联在一起,共用一个启动子序列,一起来进行表达;通过酶切检测、PCR验证和测序验证,均表明该表达载体构建成功。最后此载体在大肠杆菌中表达时,发现重组菌能够在含壮观霉素的培养基上生长,且在可见光下,能看到绿色荧光,表明壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因均在大肠杆菌中成功表达;表达产物通过Western印迹验证表明组成乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因在大肠杆菌中成功表达。以上结果表明,该表达载体中串联排列的这6个基因均在大肠杆菌中成功表达。该研究结果可为质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转叶绿体的研究奠定基础,为油菜油脂代谢研究提供参考。     

大肠杆菌系统中外源蛋白分泌的研究

要使基因工程产物达到工业化生产的规模,不仅要解决基因的高表达,还需要解决产物的分泌问题。 大肠杆菌系统中外源蛋白分泌的主要障碍是外膜,从遗传和生化两方面研究入手,通过定点突变、基因融合、构建分泌型载体等方法将可能阐明分泌的机制并找到有效的应用途径。     

鸡输卵管上皮细胞瞬时表达系统(英文)

在开发利用生物反应器生产特定蛋白的研究中,若先用特异组织作原代培养,建立瞬时表达系统,对特定调控元件和融合基因进行分析,可大大缩短研究进程。本文首次报道用鸡输卵管上皮细胞原代培养, 建立瞬时表达系统的方法。输卵管细胞体外培养(Fig.1~3),在二、三周时间内仍能保持分泌卵清蛋白的功能。当分泌功能减弱时,若在培液中添加激素,一般一周后大部分细胞又可恢复分泌功能(Fig.4)。由于卵清蛋白是一种分泌蛋白,通过斑点免疫渗滤法可迅速简便的从培液中检测到(Fig.4)。为了验证培养细胞能否表达外源基因,在原代培养细胞中转染绿色荧光蛋白基因,可在细胞浆中显示绿色荧光(Fig.5),说明这是一个有效而又方便的检测调控元件的瞬时表达系统。